Флуоресцентная химия основана на способности молекул поглощать фотон высокой энергии и испускать фотон с меньшей энергией. Этот процесс сопровождается характерным сдвигом Стокса, который является ключевым для различения возбуждающего и эмиссионного сигналов. Флуоресценция зависит от структуры молекулы, полярности среды, температуры и взаимодействия с другими молекулами. В биологических системах флуорофоры используются для визуализации макромолекул, мониторинга динамических процессов и количественного анализа биомолекул.
Ключевые параметры выбора флуорофора:
Примеры широко используемых флуорофоров включают производные родамина, флуоресцеина, кверцетина, а также белки с естественной флуоресценцией, такие как GFP и его варианты.
Ковалентная конъюгация: Флуорофоры могут быть присоединены к белкам, нуклеиновым кислотам или липидам через аминогруппы, карбоксильные группы или тиольные группы. Реакции, как правило, протекают в мягких условиях с буферными растворами, поддерживающими физиологическое pH и ионную силу, чтобы сохранить биологическую активность мишени.
Нековалентное связывание: Используются высокоаффинные взаимодействия, например, связывание биотин–авидин или интеркаляция в ДНК. Преимущество метода — отсутствие необходимости химического изменения молекулы, однако стабильность комплексов может зависеть от условий среды.
Генетическая флуоресцентная метка: Встроенные в ген код флуоресцентные белки позволяют наблюдать динамику экспрессии и локализации белков в живых клетках. Применение требует оптимизации условий экспрессии, чтобы избежать агрегации и фототоксичности.
Буферы: должны поддерживать физиологический pH и минимизировать фототоксичность. Часто применяются фосфатные и ГЭПС-буферы. Добавление антиоксидантов (например, глюкозооксидазы и каталазы) уменьшает фотоблинг и фотоблеачинг флуорофоров.
Концентрация флуорофора: баланс между достаточной интенсивностью сигнала и минимизацией самопоглощения и агрегации. Для малых молекул обычно используют нМ–мкМ диапазон; для белков — 0,1–10 мкМ.
Инкубация и смывание: после связывания флуорофора с биомолекулой необходимо удаление несвязанного реагента для снижения фонового сигнала. Используются центрифугирование, фильтрация или диализ.
Конфокальная микроскопия: обеспечивает оптический срез и уменьшает фон за счет исключения внефокусного света. Используется для изучения внутриклеточной локализации белков и динамических процессов.
Флуоресцентная спектроскопия: измеряет спектр возбуждения и эмиссии, позволяет проводить количественный анализ концентрации и конформационных изменений молекул.
Флуоресцентное резонансное переносное излучение (FRET): метод оценки близости между двумя молекулами или доменами белка. Эффективность переноса энергии зависит от расстояния между донором и акцептором и может быть использована для мониторинга динамических процессов в живых клетках.
Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS): позволяет оценивать концентрацию и диффузионные свойства молекул в малых объёмах, включая цитоплазму живых клеток.
Фотоблеачинг — необратимая потеря флуоресценции под воздействием света. Для его минимизации применяются:
Фототоксичность возникает при генерации реактивных форм кислорода в присутствии флуорофора. Уменьшение фототоксичности достигается минимизацией светового воздействия и использованием клеточно-совместимых условий инкубации.
Для количественной оценки необходимо калибровать сигнал флуорофора с известными концентрациями и учитывать коэффициенты квантового выхода, самопоглощение и влияние среды. В случае белков или нуклеиновых кислот также важна проверка однородности образца и контроль связывания флуорофора.
Флуоресцентная химия позволяет:
Эффективность применения зависит от интеграции химических свойств флуорофора с биологической системой и выбранной оптической методикой.