Проточная цитометрия и сортировка клеток

Проточная цитометрия представляет собой мощный инструмент для количественного и качественного анализа физических и химических свойств клеток и частиц в жидкости. Основной принцип метода основан на последовательном прохождении индивидуальных клеток через лазерный луч с последующей регистрацией рассеянного и флуоресцентного света.

Физические параметры клеток

Основными физическими характеристиками, измеряемыми проточной цитометрией, являются форвардное рассеяние света (FSC) и боковое рассеяние света (SSC).

• FSC коррелирует с размером клетки: чем крупнее клетка, тем больше свет рассеивается в направлении детектора.
• SSC отражает внутреннюю гранулярность или сложность структуры клетки, позволяя различать, например, лимфоциты, моноциты и гранулоциты в крови.

Эти два параметра часто используются для первичной идентификации клеточных популяций без применения специфических маркеров.

Флуоресцентная детекция

Ключевой особенностью проточной цитометрии является возможность многопараметрической флуоресцентной детекции. Клетки могут быть мечены флуоресцентными антителами, нуклеиновыми красителями или индикаторами метаболической активности. Флуоресцентные маркеры позволяют анализировать экспрессию белков, стадии клеточного цикла, уровень апоптоза, а также метаболические и функциональные характеристики.

Флуоресценция возникает, когда молекула-метка поглощает фотон определенной длины волны и переходит в возбужденное состояние, после чего возвращается в основное состояние с испусканием фотона большей длины волны. Для каждого флуорофора важны:

• Спектр возбуждения — длина волны, при которой молекула эффективно поглощает свет.
• Спектр эмиссии — длина волны излучения, фиксируемая детектором.
• Квантовый выход — эффективность преобразования поглощенной энергии в флуоресценцию.

Современные проточные цитометры оснащены несколькими лазерами и детекторами, что позволяет одновременно измерять до 20 и более флуоресцентных параметров на одной клетке.

Принципы сортировки клеток

Сортировка клеток (fluorescence-activated cell sorting, FACS) основана на разделении клеток по заданным параметрам после анализа. Процесс включает несколько этапов:

1. Гидродинамическая фокусировка — формирование клеток в одну струю для индивидуального прохождения через лазер.
2. Оптическая регистрация — измерение FSC, SSC и флуоресценции.
3. Электростатическое разнесение капель — каждая клетка попадает в каплю, которая заряжается в зависимости от анализа.
4. Электростатическое отклонение — заряженные капли отклоняются в разных направлениях с помощью электродов, обеспечивая физическое разделение клеток.

FACS позволяет выделять чистые популяции клеток для дальнейших исследований, включая молекулярный анализ, культивирование или терапевтическое применение.

Применение проточной цитометрии и FACS

• Иммунология: анализ субпопуляций лимфоцитов, определение функциональной активности и экспрессии маркеров активации.
• Онкология: обнаружение и количественный учет раковых клеток, анализ клеточного цикла опухолевых линий.
• Становление стволовых клеток: выделение и характеристика гемопоэтических и мезенхимальных стволовых клеток.
• Фармакология и токсикология: оценка влияния лекарственных соединений на жизнеспособность, апоптоз и метаболическую активность клеток.

Ограничения и особенности интерпретации

• Спектральные наложения: при использовании нескольких флуорофоров эмиссионные спектры могут перекрываться, что требует компенсации.
• Клеточная агрегация: объединение клеток в кластеры приводит к искажению FSC и SSC и затрудняет сортировку.
• Фото- и хеморазрушение: длительное воздействие лазера может снижать интенсивность флуоресценции или повреждать клетки.

Методы проточной цитометрии и FACS продолжают развиваться, внедряя новые флуорофоры, многоцветовые панели и высокопроизводительные системы, что позволяет получать точные данные о клеточных популяциях в сложных биологических системах.