Флуоресценция представляет собой спонтанное испускание света молекулой, находящейся в электронно возбужденном состоянии, при переходе в основное состояние. Время жизни флуоресценции (()) определяется как среднее время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии до излучательного перехода. Оно характеризует кинетику испускания и определяется выражением:
[ = ]
где (k_r) — константа радиативного (излучательного) перехода, (k_{nr}) — константа нерыдативных (безизлучательных) процессов, таких как внутренняя конверсия или перенос энергии.
Время жизни флуоресценции может лежать в диапазоне от пикосекунд до миллисекунд, что зависит от природы молекулы и окружающей среды.
Существуют два основных подхода: статистические (непрерывные) и импульсные (временные) методы. Они отличаются принципами регистрации и анализа флуоресцентного сигнала.
При непрерывном облучении образца флуоресцентный сигнал достигает установившегося уровня. Время жизни может быть оценено косвенно через квантовый выход и интенсивность флуоресценции:
[ = = k_r ]
где () — квантовый выход флуоресценции. Этот метод ограничен для сложных смесей, так как не позволяет различать многокомпонентные экспоненциальные распады.
Импульсные методы позволяют напрямую измерять кинетику распада возбуждённых состояний во времени и являются наиболее информативными.
Суть метода заключается в возбуждении молекул коротким импульсом света (лазерным или вспышкой) и последующей регистрации флуоресценции как функции времени. Флуоресцентный сигнал (I(t)) описывается экспоненциальным законом:
[ I(t) = I_0 e^{-t/}]
Для многокомпонентных систем используется многокомпонентная экспоненциальная аппроксимация:
[ I(t) = _i _i e^{-t/_i}]
где (_i) — амплитудные коэффициенты каждого компонента, (_i) — соответствующие времена жизни.
Регистрация сигнала осуществляется с помощью высокоскоростных фотонных детекторов, например, фотомножителей или SPAD (Single-Photon Avalanche Diodes), в сочетании с временными схемами, такими как TCSPC.
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) основан на детектировании отдельных фотонов и измерении времени задержки относительно импульса возбуждения. Принцип работы включает:
Преимущества TCSPC: высокая временная разрешающая способность (до десятков пикосекунд), возможность измерения слабых сигналов и многокомпонентных распадов.
Метод основан на модуляции интенсивности возбуждающего света с частотой (). Флуоресценция модулируется с запаздыванием по фазе () и с уменьшенной амплитудой относительно возбуждения. Время жизни определяется по выражению:
[ = ]
Для многокомпонентных систем используются многокомпонентные модели фазового сдвига. Преимущества метода: измерение в реальном времени без необходимости высокоскоростной регистрации отдельных фотонов, совместимость с потоковыми и живыми образцами.
Временная характеристика флуоресценции является ключевым параметром, обеспечивающим качественную и количественную информацию о динамике электронных состояний молекул и окружающей среды.