Флуориметрия основана на явлении флуоресценции — испускании света молекулами после поглощения фотонов с более высокой энергией. Основными характеристиками флуоресценции являются длина волны возбуждения, длина волны эмиссии, квантовый выход и время жизни возбужденного состояния. Измерение интенсивности флуоресценции требует точного контроля экспериментальных условий, поскольку сигнал чувствителен к концентрации вещества, растворителю, температуре и присутствию примесей.
Флуориметры используются для количественного анализа, где ключевой параметр — интенсивность излучения, пропорциональная концентрации флуорофора при низких концентрациях (закон Стокса). Для получения достоверных данных необходима тщательная калибровка прибора.
Базовая характеристика включает измерение фонового сигнала и линией нулевой интенсивности. Фоновый сигнал формируется за счет рассеяния света, паразитной флуоресценции кюветы или оптики, и электронного шума детектора. Для его определения используют раствор без флуорофора или чистый растворитель, идентичный экспериментальному.
Ключевой момент: фон должен быть стабилен во времени. Любое изменение фона требует повторной калибровки.
Стандартизация прибора проводится с помощью флуоресцентных стандартов с известным квантовым выходом и стабильными спектральными характеристиками. Наиболее распространенные стандарты:
Стандарты позволяют определить коэффициент преобразования сигнала детектора в концентрацию и проверить линейность отклика прибора.
Флуориметр должен точно определять спектральные позиции возбуждения и эмиссии. Для этого применяются эталонные люминофоры с известными максимумами излучения, например, хлорофиллы или флуоресцеин. Калибровка включает:
Точная настройка спектральной шкалы критически важна для исследования смещений пиков флуоресценции, особенно при анализе сложных смесей.
Флуориметр обладает ограничением по диапазону концентраций, в котором интенсивность линейно зависит от концентрации флуорофора. Для проверки линейности выполняют серию разбавлений стандартного раствора и строят график интенсивность — концентрация.
Ключевые моменты:
Флуоресценция чувствительна к температуре. Приборы должны работать в термостатированных условиях или с контролем температуры кюветы. Важна также стабильность источника возбуждения, поскольку лампы и лазеры имеют ограниченный срок службы, а их интенсивность со временем изменяется.
Регулярная проверка воспроизводимости измерений проводится через повторное измерение одного и того же стандартного раствора. Погрешность определяется как стандартное отклонение серии измерений. Этот параметр отражает точность калибровки и стабильность системы в целом.
Калибровка флуориметра обеспечивает:
Правильная калибровка — фундаментальная процедура, без которой любые количественные или качественные выводы о флуоресценции становятся ненадежными.