Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET, Förster Resonance Energy Transfer) представляет собой квантово-механический процесс безызлучательного переноса энергии от возбужденного донора флуорофора к акцептору. Этот процесс критически зависит от нескольких факторов: расстояния между донором и акцептором, спектрального перекрытия эмиссии донора и абсорбции акцептора, а также ориентации дипольных моментов молекул.
Энергия передается эффективно, когда расстояние между флуорофорами находится в диапазоне 1–10 нм, что делает FRET уникальным инструментом для измерения молекулярных расстояний на наноуровне. Степень передачи энергии характеризуется коэффициентом FRET (E), который зависит от расстояния (r) и радиуса Форстера (R_0):
[ E = ]
где (R_0) — расстояние, на котором эффективность переноса энергии достигает 50%.
Ключевым условием эффективного FRET является спектральное перекрытие: эмиссия донора должна совпадать с поглощением акцептора. Выбор флуорофоров определяется следующими параметрами:
Для биологических систем чаще используют пары, например, CFP–YFP, GFP–RFP, где спектральные характеристики обеспечивают высокую эффективность FRET и минимизацию перекрестного излучения.
Существует несколько подходов к количественной оценке эффективности переноса энергии:
Интенсивностный метод Измеряется изменение интенсивности флуоресценции донора и акцептора при возбуждении донора. Эффективность FRET рассчитывается как:
[ E = 1 - ]
где (F_D) — интенсивность флуоресценции донора в присутствии акцептора, (F_{D0}) — интенсивность донора в отсутствие акцептора. Метод прост, но чувствителен к концентрационным эффектам и фотобленчингам.
Метод времени жизни флуоресценции Измеряется уменьшение времени жизни возбужденного состояния донора при наличии акцептора. Эффективность определяется как:
[ E = 1 - ]
где (D) — время жизни донора с акцептором, ({D0}) — без акцептора. Этот метод не зависит от концентрации флуорофоров, что делает его более точным для биологических систем.
Спектральный метод Анализируется полное изменение спектра флуоресценции системы, позволяя учитывать как прямое возбуждение акцептора, так и пересечение спектров. Применяется при сложных системах с несколькими флуорофорами.
Основная цель FRET — определение расстояний на наномасштабе. Радиус Форстера (R_0) рассчитывается через физико-химические параметры флуорофоров:
[ R_0^6 = 8.79 ^{-28} ^2 n^{-4} _D J]
где:
Расстояние между молекулами определяется через формулу:
[ r = R_0 ( - 1 )^{1/6}]
Данный подход позволяет измерять межмолекулярные и внутримолекулярные расстояния с точностью до 1 нм.
Метод FRET является ключевым инструментом современной молекулярной биофизики, позволяя исследовать динамические процессы на наноуровне, недоступные для классических спектроскопических методов.