Флуоресценция одиночных молекул

Основные принципы флуоресценции

Флуоресценция представляет собой люминесценцию, возникающую вследствие поглощения молекулой фотонов и последующего излучения света при возвращении в основное состояние. Для одиночных молекул характерны специфические спектральные и кинетические свойства, отличающие их от ансамблей молекул. В отличие от макроскопических систем, где усредняются взаимодействия между множественными молекулами, отдельная молекула демонстрирует дискретные переходы и стохастические флуктуации интенсивности излучения.

Энергетические состояния молекулы

Молекула в основном состоянии (S_0) может поглотить фотон с энергией (h), переходя в возбужденное электронное состояние (S_1) или выше ((S_n), (n>1)). После быстрой внутренней конверсии и вибрационного релаксации молекула стабилизируется в нижнем возбужденном состоянии (S_1). Основные процессы возврата в (S_0) включают:

• Флуоресценцию — спонтанное излучение фотона с длиной волны (_f), зависящей от разницы энергии между состояниями (S_1) и (S_0).
• Нефлуоресцентные каналы — внутреннее конверсии и межсистемное переходное квантовое туннелирование в триплетное состояние (T_1).

Квантовый выход флуоресценции (_f) определяется как отношение числа излученных фотонов к числу поглощенных. Для одиночных молекул (_f) может значительно колебаться из-за фотобликования и динамических конформационных изменений.

Спектральные характеристики одиночных молекул

Спектр флуоресценции отдельной молекулы не усреднен и отражает конкретную электронно-вибрационную структуру. Для большинства органических красителей наблюдаются:

• Полосы Стикинга (Stokes shift) — сдвиг излучаемой длины волны относительно поглощения, обусловленный релаксацией молекулы в возбужденном состоянии.
• Спектральная неоднородность — различие спектров между молекулами одного типа, вызванное локальной микросредой.
• Флуктуации интенсивности — «blinking», периодическое выключение и включение излучения, связанное с переходами в метастабильные состояния или фотохимическую деградацию.

Фотофизические процессы и кинетика

Возбужденная молекула подвержена конкурирующим процессам:

[ S_1 S_0 + h()] [ S_1 S_0 ()] [ S_1 T_1 ()]

Где (k_f), (k_{nr}), (k_{isc}) — константы скоростей соответствующих процессов. Среднее время жизни возбужденного состояния () определяется как

[ = ]

Для одиночных молекул измерение () методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии или времени жизни одиночного фотона позволяет выявлять стохастические переходы между состояниями.

Флуоресцентное блескание и фотобликование

Фотобликование — это случайное временное прекращение флуоресценции отдельной молекулы. Причины включают:

• Переход в триплетное состояние с большой жизнью ((s - ms)).
• Образование фотохимически инертных радикальных состояний.
• Влияние локальной среды, например, кислород или полярные растворители.

Моделирование блескания выполняется с помощью многосостоянных кинетических схем, что позволяет количественно описывать вероятности переходов и среднее время включения/выключения излучения.

Методы наблюдения одиночных молекул

Флуоресценцию отдельной молекулы регистрируют с помощью:

• Конфокальная микроскопия — позволяет изолировать отдельные молекулы в объеме фокусировки лазера.
• Суперразрешающая флуоресцентная микроскопия — STED, PALM, STORM, позволяющие локализовать молекулы с точностью ниже дифракционного предела.
• Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) — измеряет временные корреляции флуоресценции, определяя динамику и концентрацию молекул.

Каждый метод требует высокой фотостабильности красителей, чувствительных детекторов (например, АВП-фотонные умножители или SPAD), а также оптимизации среды для подавления фотодеструкции.

Влияние микросреды на флуоресценцию

Поведение одиночной молекулы сильно зависит от локальной микросреды:

• Полярность растворителя влияет на сдвиг полос и квантовый выход.
• Вязкость среды замедляет релаксацию и может увеличивать время жизни (S_1).
• Взаимодействие с поверхностями или белками может вызывать спектральные переходы или фотобликование.

Эти эффекты позволяют использовать флуоресценцию одиночных молекул для изучения конформационных изменений биомолекул и динамики наноструктур.

Применение флуоресценции одиночных молекул

• Изучение кинетики биохимических реакций на уровне отдельных молекул.
• Локализация и отслеживание отдельных белков, нуклеиновых кислот и наночастиц.
• Разработка высокочувствительных датчиков и фотостабильных красителей для биомедицинских исследований.
• Основы для квантовой оптики и фотонных источников одиночных фотонов.

Флуоресценция одиночных молекул обеспечивает уникальный доступ к стохастическим процессам и динамике, которые скрыты в ансамблевых измерениях. Анализ индивидуальных переходов, времени жизни и спектральной неоднородности позволяет раскрывать фундаментальные фотофизические механизмы и строить модели микросреды с молекулярной точностью.