Флуоресценция — это люминесценция, возникающая при поглощении молекулой фотона высокой энергии с последующим испусканием фотона меньшей энергии. В молекулярной химии этот процесс обусловлен переходами электронов между энергетическими уровнями. После возбуждения молекулы до синглетного возбужденного состояния она может терять часть энергии нерадиационными процессами, а оставшуюся — излучать в виде видимого света. Ключевыми параметрами флуоресценции являются спектр возбуждения, спектр эмиссии, квантовый выход и время жизни возбужденного состояния.
Молекулы, способные к флуоресценции, называются флуорофорами. Их структура обычно включает конъюгированные π-системы, которые обеспечивают стабилизацию возбужденного состояния и высокую вероятность излучательного перехода. Важное значение имеет химическая среда, полярность растворителя и взаимодействие с другими молекулами, что может приводить к сдвигам спектров или квенчингам флуоресценции.
Флуоресцентные методы в клеточной биологии можно разделить на несколько основных категорий:
Молекулярные зонды — органические или неорганические соединения, способные селективно связываться с биомолекулами или ионами и изменять свои флуоресцентные свойства. Примеры: DAPI для ДНК, Fluo-4 для кальция.
Белки, генетически кодируемые как флуоресцентные — такие как GFP и его варианты. Их экспрессия в живых клетках позволяет отслеживать локализацию и динамику белков в реальном времени.
Флуоресцентная мечение макромолекул — химическая модификация белков или липидов с помощью флуоресцентных красителей, включая реагенты NHS-эфиров или maleimide.
Флуоресцентная микроскопия с разрешением сверхдифракционного предела — методы STED, PALM, STORM, которые используют специальные фотофизические свойства флуорофоров для преодоления ограничений обычной оптической микроскопии.
Спектральный анализ включает регистрацию интенсивности излучения в зависимости от длины волны, что позволяет идентифицировать флуорофор и количественно оценивать его концентрацию. Флуориметрия используется для измерения общей интенсивности флуоресценции в растворе или суспензии клеток. В клеточной биологии основным инструментом является флуоресцентная микроскопия, где применяются фильтры для селективного возбуждения и регистрации света.
Важное свойство флуоресценции — флуоресцентная аннигиляция (quenching), возникающая при взаимодействии с кислородом, протонами, ионами металлов или другими молекулами. Понимание механизмов аннигиляции критично для интерпретации экспериментов.
Время жизни флуоресценции (τ) — интервал между возбуждением молекулы и испусканием фотона. Измерение τ позволяет различать флуорофоры с перекрывающимися спектрами, что используется в методах FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy).
Ионные зонды позволяют визуализировать динамику внутриклеточных ионов: кальция, магния, водорода, натрия. Например, Fluo-4 и Indo-1 изменяют интенсивность или спектр флуоресценции при связывании Ca²⁺.
Реактивные формы кислорода и редокс-зонды (например, roGFP, HyPer) позволяют отслеживать оксидативный стресс и состояние митохондрий.
Флуоресцентные метки для белков включают GFP и его спектральные варианты. Фьюжн белок GFP с исследуемым белком позволяет наблюдать его локализацию, движение и взаимодействия в реальном времени.
Флуоресцентные красители мембран (DiI, DiO, FM-дейные красители) обеспечивают визуализацию морфологии клеточной мембраны, эндоцитоза и динамики органелл.
FRET (Förster Resonance Energy Transfer) — метод, основанный на передаче энергии между двумя близко расположенными флуорофорами. Эффективность передачи зависит от расстояния между донором и акцептором (1–10 нм), что позволяет изучать белково-белковые взаимодействия, компартментализацию и conformational changes.
FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) используется для оценки подвижности молекул и динамики мембран. После локального «выжигания» флуоресценции исследуется скорость восстановления сигнала за счет диффузии.
FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) измеряет флуктуации интенсивности излучения в малом объёме, предоставляя информацию о концентрации молекул, их диффузии и агрегатном состоянии.
Сверхдифракционные методы используют фотофизические свойства флуорофоров для преодоления ограничений разрешения света (~200 нм):
Эти методы открыли возможность изучать наноструктуру клеточных органелл, сигнальные комплексы и динамику белков с молекулярной точностью.
Флуоресцентная химия объединяет фундаментальные принципы фотофизики и современные биологические приложения, позволяя получать уникальные сведения о структуре, динамике и функции клеток на молекулярном уровне.