Флуоресцентное мечение ДНК и РНК представляет собой процесс присоединения к молекулам нуклеиновых кислот флуоресцентных группировок, которые способны излучать свет при возбуждении соответствующей длиной волны. Это ключевой инструмент в молекулярной биологии, биохимии и медицинской диагностике, обеспечивающий возможность высокочувствительного анализа структуры, концентрации и локализации нуклеиновых кислот.
Флуоресцентные метки обладают специфическими фотофизическими свойствами: высокой квантовой эффективностью, устойчивостью к фотоблеканию и определённой длиной волны возбуждения и излучения. Выбор флуорофора зависит от цели эксперимента, условий среды и спектрального перекрытия с другими метками в многоцветных анализах.
Малые органические флуорофоры Наиболее часто используются модифицированные производные родамина, флуоресцеина, Cy-диевы (Cy3, Cy5). Они обладают высокой яркостью, малой стерической нагрузкой и легко конъюгируются с нуклеотидными основаниями через аминогруппы или тиольные модификации.
Флуоресцентные белки Хотя чаще применяются в живых системах, GFP-подобные белки могут использоваться для изучения взаимодействий нуклеиновых кислот с белками в составе репортерных конструкций.
Флуоресцентные нуклеотидные аналоги Некоторые основания (например, 2-аминопурин) сами по себе флуоресцируют, что позволяет создавать метки внутри цепи без присоединения внешнего флуорофора. Эти аналоги позволяют исследовать динамику структуры и конформационные изменения ДНК/РНК.
Химическое присоединение Метки конъюгируются к 5’- или 3’-концу олигонуклеотида через функциональные группы. Например, фосфоамидация позволяет соединить флуорофор с 5’-фосфатной группой, сохраняя структуру нуклеотида.
Инкорпорация в процессе синтеза Флуоресцентные нуклеотидные аналоги включаются непосредственно в олигонуклеотид во время химического синтеза.
Несвязанные интеркаляционные красители Некоторые красители (например, SYBR Green, Ethidium Bromide) связываются с двойной спиралью нуклеиновой кислоты и становятся флуоресцентными только в комплексе с ДНК/РНК.
Флуоресценция нуклеиновых кислот определяется четырьмя ключевыми параметрами:
Квантификация и визуализация нуклеиновых кислот Используется в анализах по принципу Флуоресцентного количественного ПЦР (qPCR), где интенсивность сигнала прямо пропорциональна количеству амплифицированного продукта.
Исследование структуры и динамики ДНК/РНК Флуоресцентные аналоги позволяют отслеживать гибкость спирали, образование шпилек и петлей, а также конформационные переходы.
Флуоресцентная гибридизация (FISH) Мечение длинных зондов ДНК или РНК позволяет локализовать специфические гены или транскрипты в клетке и визуализировать их распределение.
Энергетический перенос флуоресценции (FRET) Позволяет исследовать взаимодействия между нуклеотидными последовательностями или между нуклеиновыми кислотами и белками, регистрируя изменение энергии между донором и акцептором.
Флуоресцентное мечение ДНК и РНК остается ключевым инструментом в современных молекулярных исследованиях, обеспечивая точный количественный и пространственный анализ нуклеиновых кислот, а также изучение их структурных и функциональных свойств.