Флуоресцентная поляризация в аналитической химии

Флуоресцентная поляризация (ФП) — это физико-химический метод, основанный на измерении степени поляризации света, излучаемого флуоресцентными молекулами после возбуждения поляризованным светом. При поглощении поляризованного света молекулой с флуорофором, излучаемое световое излучение сохраняет часть исходной поляризации. Степень сохранения поляризации зависит от вращательной подвижности молекул в растворе и времени жизни возбужденного состояния.

Если молекула большая или связана с макромолекулой, вращение замедляется, что приводит к высокому уровню поляризации излучения. Напротив, малые свободно вращающиеся молекулы демонстрируют низкую флуоресцентную поляризацию. Это делает ФП чувствительным инструментом для исследования взаимодействий молекул, связывания лиганд–рецептор и оценки кинетики реакций в растворе.

Физическая основа метода

Поляризация света определяется как векторная характеристика колебаний электромагнитного поля. Если возбуждающий свет линейно поляризован, молекулы, ориентированные вдоль направления колебаний поля, будут поглощать фотон с большей вероятностью. После возбуждения молекулы флуоресценция испускается в течение времени жизни возбужденного состояния, а вращение молекулы между возбуждением и эмиссией приводит к деполяризации света.

Степень флуоресцентной поляризации ( P ) определяется выражением:

[ P = ]

где ( I_{} ) и ( I_{} ) — интенсивности флуоресценции, измеренные соответственно в направлениях, параллельном и перпендикулярном поляризации возбуждающего света.

Для количественного анализа также используется анисотропия ( r ):

[ r = ]

Анизотропия связана с вращательной корреляцией молекул и временем жизни флуорофора () по уравнению Форстера–Джонса–Скорка:

[ r = ]

где ( r_0 ) — фундаментальная анизотропия, () — вращательная корреляционная константа, обратно пропорциональная вязкости среды и объему молекулы.

Практическое применение

Флуоресцентная поляризация получила широкое распространение в аналитической химии, биохимии и фармакологии. Основные области применения:

• Изучение взаимодействий лиганд–рецептор: малые флуоресцентные лигандные молекулы, связываясь с крупными белками, демонстрируют рост ФП за счет замедления вращения. Этот эффект используется для определения констант связывания и оценки кинетики взаимодействий.
• Высокопроизводительные скрининговые тесты (HTS): метод позволяет измерять связывание белок–лиганда в микропланшетах без необходимости отделения несвязанного флуорофора.
• Определение концентрации молекул: изменение флуоресцентной поляризации при связывании позволяет косвенно измерять концентрацию целевых соединений.
• Изучение динамики макромолекул: ФП используется для оценки размеров и агрегирования белков, нуклеиновых кислот и полимеров.

Технические аспекты измерений

При измерении флуоресцентной поляризации важны несколько факторов:

• Выбор флуорофора: предпочтение отдаётся молекулам с высокой фундаментальной анизотропией и длительным временем жизни возбужденного состояния.
• Оптическая система: требуется лазер или лампа с линейно поляризованным светом и детекторы с поляризационными фильтрами для регистрации ( I_{} ) и ( I_{} ).
• Температурный контроль и вязкость среды: оба параметра влияют на вращательную подвижность молекул и, следовательно, на измеряемую поляризацию.
• Концентрационный диапазон: высокая концентрация флуорофора может привести к внутренней фильтрации и самопоглощению, что снижает точность измерений.

Преимущества и ограничения метода

Преимущества:

• Метка не требует отделения несвязанного флуорофора.
• Метод чувствителен к малым изменениям в размерах и динамике молекул.
• Совместим с автоматизированными анализаторами и HTS.

Ограничения:

• Чувствительность зависит от времени жизни флуорофора и размеров молекул.
• Влияние среды, вязкости и температуры требует строгого контроля.
• Некоторые флуорофоры могут демонстрировать фотоблекание и вращательную анизотропию, зависящую от специфических взаимодействий с растворителем.

Современные тенденции

Развитие методов временной и спектральной флуоресцентной поляризации позволяет расширить аналитические возможности. Временная ФП измеряет изменение анизотропии во времени после короткого лазерного импульса, обеспечивая более точное определение кинетики вращения молекул. Спектральная ФП сочетает информацию о длине волны и поляризации, что повышает избирательность анализа в сложных биомолекулярных системах.

Использование компьютерного моделирования и методов молекулярной динамики позволяет прогнозировать поведение флуоресцентных меток в различных средах и оптимизировать дизайн аналитических экспериментов.

Флуоресцентная поляризация продолжает оставаться одним из наиболее информативных и чувствительных методов для исследования молекулярных взаимодействий, позволяя получать количественные данные о структуре, динамике и взаимодействиях биомолекул в растворе.