Флуоресцентная корреляционная спектроскопия

Основы флуоресценции

Флуоресценция представляет собой процесс поглощения молекулю фотона с последующим излучением фотона с меньшей энергией. При этом происходит переход электрона из основного состояния (S_0) в возбужденное (S_1) или (S_2), а затем возврат в (S_0) с испусканием света. Разница между энергиями поглощённого и излучённого фотона называется стоксовым сдвигом. Этот эффект используется для изучения динамики молекул, их концентраций и взаимодействий на уровне отдельных частиц.

Ключевыми параметрами флуоресценции являются:

  • Квантовый выход – отношение числа излучённых фотонов к числу поглощённых.
  • Время жизни возбужденного состояния – среднее время нахождения молекулы в (S_1).
  • Спектр излучения – распределение интенсивности по длинам волн.

Принципы флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС)

ФКС основана на анализе флуктуаций интенсивности флуоресценции в малом объёме наблюдения. Малые объёмы создаются фокусировкой лазерного пучка через объектива высокого числового апертурного числа. Эти флуктуации обусловлены:

  • диффузией молекул через объём наблюдения,
  • химическими реакциями и переходами между состояниями,
  • связыванием и диссоциацией комплексов.

Основным инструментом анализа является автокорреляционная функция интенсивности (G()):

[ G() = ]

где (I(t) = I(t) - I(t) ), (I(t)) – мгновенная интенсивность, () – задержка во времени. Автокорреляционная функция отражает характерные времена процессов, происходящих в наблюдаемом объёме, и позволяет определять коэффициенты диффузии, концентрацию молекул и динамику взаимодействий.

Теоретические основы

В классическом случае для одномерной диффузии молекул в объёме наблюдения функция автокорреляции имеет вид:

[ G() = ( 1 + )^{-1} ( 1 + )^{-1/2}]

где:

    1. – среднее число флуоресцирующих частиц в объёме наблюдения,
  • (_D) – характерное время диффузии через объём,
  • (= z_0 / _0) – отношение осевого и радиального размеров объёма наблюдения.

Для анализа взаимодействий двух типов молекул используется двухцветная ФКС, где корреляция интенсивности по двум каналам позволяет оценить долю комплексов и скорость связывания.

Методология измерений

  1. Выбор флуорофора: стабильный к фотоблеканию, высокий квантовый выход, чувствительный к среде.
  2. Фокусировка объёма наблюдения: обычно лазер с высокой числовой апертурой, объём порядка фемтолитров.
  3. Регистрация интенсивности: фотонные умножители или APD с временным разрешением порядка наносекунд.
  4. Анализ автокорреляционных функций: подгонка моделей для определения коэффициентов диффузии, времени жизни и концентрации.

Применения

ФКС позволяет получать количественные данные о молекулярной динамике в реальном времени в условиях физиологической среды. Основные направления применения:

  • Биомолекулярные исследования: определение конформационных изменений белков и нуклеиновых кислот, измерение скорости связывания лигандов.
  • Изучение мембран: диффузия липидов и белков в липидных бислоях и клеточных мембранах.
  • Коллоидные системы: оценка размеров и концентрации наночастиц в растворе.
  • Химическая кинетика: мониторинг быстрых реакций и переходов между состояниями флуорофоров.

Ограничения и источники ошибок

  • Фотоблекание приводит к искажению автокорреляционной функции.
  • Неидеальная калибровка объёма наблюдения может изменить рассчитанную концентрацию.
  • Низкая концентрация частиц увеличивает шум и требует длительного времени регистрации.
  • Агрегация молекул приводит к завышенным значениям коэффициентов диффузии.

Расширенные методы

  • Сканирующая ФКС (sFCS) – анализ флуктуаций при движении лазерного пучка, позволяет измерять диффузию в мембранах.
  • Имиджевая ФКС (ImFCS) – пространственное картирование флуктуаций с высоким разрешением.
  • ФКС с временем жизни флуоресценции (FLCS) – разделение сигналов по временам жизни, улучшая чувствительность при смешанных системах.

Флуоресцентная корреляционная спектроскопия объединяет принципы молекулярной флуоресценции и статистического анализа, обеспечивая уникальный доступ к динамике, концентрации и взаимодействиям молекул на микро- и наноуровне. Она является мощным инструментом в современной физико-химической биологии и нанохимии, позволяя получать количественные данные без разрушения образца.

Оглавление