Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH, от англ. Fluorescence In Situ Hybridization) представляет собой метод визуализации и локализации специфических нуклеотидных последовательностей в клетках или тканях с использованием флуоресцентно меченых зондов. Метод основан на специфическом связывании одноцепочечной ДНК или РНК-зонды с комплементарными последовательностями в фиксированных биологических образцах, что позволяет выявлять генетические и структурные особенности на уровне отдельных клеток.
Специфичность зондов. Ключевым элементом метода является зонд — одноцепочечная нуклеиновая кислота, меченная флуорофором. Зонды могут быть ДНК, РНК или модифицированными олигонуклеотидами. Специфичность определяется комплементарностью последовательностей зонда и целевой ДНК или РНК.
Флуоресценция. Флуоресцентная метка поглощает свет на одной длине волны и испускает на другой. Различные флуорофоры позволяют одновременно детектировать несколько последовательностей. Наиболее часто используются флуоресцеин (FITC), родамин, Cy3 и Cy5, отличающиеся спектральными характеристиками и фотостабильностью.
Гибридизация. Процесс связывания зонда с целевой последовательностью включает денатурацию ДНК или РНК, при которой двойная спираль расплетается, и последующую гибридизацию с одноцепочечным зондом при оптимальных температуре и ионной силе. Специфические условия предотвращают неселективное связывание и обеспечивают высокую точность детекции.
Фиксация образца. Образцы клеток или тканей фиксируются химическими агентами (формалин, этанол) для сохранения морфологии и стабилизации нуклеиновых кислот. Фиксация предотвращает деградацию ДНК/РНК и сохраняет доступность целевых последовательностей для гибридизации.
Препарирование и денатурация. Для успешной гибридизации требуется денатурация двойной спирали ДНК, обычно с помощью высоких температур или щелочных растворов. Этот этап формирует одноцепочечные участки, доступные для зондов.
Гибридизация с флуоресцентным зондом. Зонд добавляется к образцу в условиях, обеспечивающих специфическое связывание. Время и температура гибридизации подбираются индивидуально для каждой пары зонд–мишень.
Смыв несвязавшихся зондов. После гибридизации образец промывается, чтобы удалить несвязавшиеся зонды. Строгие условия промывания уменьшают фоновую флуоресценцию и повышают контрастность изображения.
Визуализация и анализ. Детекция проводится с использованием флуоресцентного микроскопа или конфокальной системы. Современные методы позволяют количественно оценивать экспрессию генов, локализацию хромосом и структурные перестройки.
Цитогенетика. FISH широко используется для выявления численных и структурных аномалий хромосом, включая делеции, дупликации и транслокации. Метод обеспечивает высокую разрешающую способность на уровне отдельных клеток, что невозможно при классической кариотипизации.
Молекулярная диагностика. Применение FISH в онкологии позволяет детектировать специфические хромосомные перестройки, характерные для лейкозов, лимфом и твердых опухолей. Например, идентификация транслокации BCR-ABL в хроническом миелолейкозе осуществляется с помощью специфических флуоресцентных зондов.
Исследование экспрессии генов. FISH позволяет определять локализацию и количество транскриптов внутри клеток, включая изучение экспрессии микроРНК и других регуляторных РНК.
Микробиология. В экологических и клинических исследованиях FISH применяется для идентификации микроорганизмов в сложных сообществах без необходимости их культивирования.
FISH представляет собой интегративный метод, объединяющий основы молекулярной биологии, цитогенетики и флуоресцентной химии. Его точность и визуальная информативность делают метод незаменимым инструментом в современной генетической диагностике, исследовании структуры хромосом и анализе экспрессии генов на клеточном уровне.