Двухфотонная флуоресцентная микроскопия (ДФМ) основана на явлении
одновременного поглощения двух фотонов низкой энергии, которые совместно
обеспечивают возбуждение молекулы до возбужденного состояния,
аналогичного возбуждению одним фотоном высокой энергии. Энергия двух
фотонов суммируется, обеспечивая переход молекулы из основного состояния
в возбужденное, после чего происходит эмиссия флуоресценции на длине
волны, характерной для данного флуорофора.
Ключевые особенности:
- Использование инфракрасного возбуждения, что снижает фототоксичность
и фотоблеaching.
- Локализованное возбуждение в фокальной области, благодаря
квадратичной зависимости вероятности двухфотонного поглощения от
интенсивности света.
- Глубокое проникновение в ткань (до 1 мм), что позволяет изучать
толстые биологические образцы без значительного рассеяния сигнала.
Механизм двухфотонного
поглощения
Вероятность двухфотонного поглощения пропорциональна квадрату
интенсивности падающего света. В отличие от одномоментного поглощения
одного фотона, двухфотонное возбуждение требует высокой плотности
фотонного потока, обычно создаваемой импульсными титан-сапфировыми
лазерами с длительностью импульса порядка фемтосекунд.
Молекула после двухфотонного возбуждения возвращается в основное
состояние с испусканием флуоресценции. Так как зона возбуждения строго
ограничена фокусом объектива, фоновой флуоресценции из внефокальных
областей практически нет, что обеспечивает высокое пространственное
разрешение.
Оптическая система
Основные компоненты системы включают:
- Импульсный лазер с высокой пиковой интенсивностью и
длиной волны 700–1100 нм.
- Сканирующий модуль для перемещения фокальной точки
по образцу.
- Объективы высокой числовой апертуры (NA) для
концентрации света в малый объем.
- Детекторы с высокой квантовой эффективностью,
обычно фотомножители или специализированные детекторы с гейтом
времени.
Особое внимание уделяется коррекции хроматической аберрации и
минимизации потерь света при передаче сигнала к детекторам.
Флуорофоры и их свойства
Для двухфотонного возбуждения подходят как стандартные органические
красители, так и белки с естественной флуоресценцией. Важные
параметры:
- Двухфотонный сечение поглощения (σ₂): мера
эффективности двухфотонного возбуждения, выражается в Гёптерах
(GM).
- Флуоресцентный выход (Φ): отношение числа
испущенных фотонов к числу поглощенных.
- Стабильность к фотоблеканию: критический фактор для
длительных наблюдений живых клеток.
Некоторые флуоресцентные белки (GFP, RFP) демонстрируют значительно
меньшие σ₂, что требует увеличения интенсивности лазера, но при этом
сохраняет преимущество локализации сигнала.
Применение в биологии и
медицине
ДФМ позволяет наблюдать живые ткани с минимальным повреждением и
фототоксичностью. Среди ключевых областей применения:
- Клеточная динамика: отслеживание транспорта
органелл, цитоскелетных структур, эндоцитоза.
- Нейронаука: визуализация активности нейронов на
глубине до 1 мм, регистрация кальциевых сигналов в живых мозговых
срезах.
- Иммунология: изучение миграции клеток иммунной
системы в органах с высокой оптической плотностью.
- Фармакокинетика: локализация и динамика введенных
лекарственных молекул в живых тканях.
Преимущества и ограничения
Преимущества:
- Минимизация фототоксического воздействия на клетки.
- Глубокое проникновение в ткань с высоким пространственным
разрешением.
- Снижение флуоресцентного фона из внефокальных областей.
Ограничения:
- Требуется сложное и дорогостоящее оборудование.
- Высокие требования к стабильности и мощности лазерного
источника.
- Ограниченный выбор флуорофоров с достаточным двухфотонным
сечением.
Современные
усовершенствования
- Мультифотонная микроскопия (трёх- и более фотонное
возбуждение) для ещё более глубокого проникновения.
- Адаптивная оптика для коррекции искажений при
работе с оптически плотными образцами.
- Совмещение с оптической когерентной томографией для
получения структурной информации параллельно с флуоресцентной.
- Гибридные детекторы и временное гейтовое
считывание, повышающие чувствительность и снижающие шум.
Двухфотонная флуоресцентная микроскопия стала фундаментальным
инструментом для изучения сложных биологических систем, обеспечивая
беспрецедентную возможность визуализации процессов на молекулярном
уровне в живых тканях.