Хроматография представляет собой совокупность методов разделения компонентов сложных смесей на основе различий в их распределении между двумя фазами: неподвижной и подвижной. Основной принцип метода заключается в различной скорости движения компонентов смеси через неподвижную фазу под действием подвижной фазы. Разделение происходит благодаря различной адсорбционной способности, растворимости или молекулярным взаимодействиям веществ с фазами.
1. Адсорбционная хроматография Основана на различной адсорбционной способности компонентов смеси к поверхности неподвижной фазы. Наиболее часто используется силикагель, оксид алюминия или активированный уголь. Подвижная фаза может быть жидкой (для колоночной или тонкослойной хроматографии) или газообразной (в газовой хроматографии с адсорбционными колонками).
2. Разделение по растворимости (разделение по распределению) Использует различие в растворимости компонентов смеси между двумя несмешивающимися фазами, например, жидкость–жидкость или жидкость–твердая фаза. Классическим примером является жидкостная хроматография на колонках с неподвижной фазой в виде силикагеля, пропитанного жидкостью, или жидкостная хроматография высокого давления (ВЭЖХ).
3. Ионообменная хроматография Основана на электростатических взаимодействиях между заряженными группами на поверхности неподвижной фазы и ионами компонентов смеси. Применяется для разделения аминокислот, белков, нуклеиновых кислот, пептидов. Неподвижная фаза содержит функциональные группы с положительным или отрицательным зарядом, что обеспечивает селективное связывание ионов.
4. Гель-проникающая (гель-фильтрационная) хроматография Метод разделения по молекулярному размеру. Неподвижная фаза представляет собой пористый гель. Молекулы, размер которых превышает поры геля, проходят быстрее, тогда как более мелкие частицы задерживаются внутри пор. Применяется для разделения белков, полисахаридов и макромолекул.
5. Газовая хроматография Использует газообразную подвижную фазу. Разделение компонентов смеси происходит на основе различий их летучести и взаимодействия с неподвижной фазой, нанесенной на поверхность инертного носителя. Газовая хроматография широко используется для анализа летучих органических соединений, растворителей и легких органических молекул.
1. Разрешающая способность (Rs) Показатель эффективности разделения двух компонентов. Определяется как отношение разности времен удерживания компонентов к средней ширине пиков. Чем выше Rs, тем лучше качество разделения.
2. Время удерживания (tR) Время прохождения компонента через колонку от момента введения пробы до регистрации сигнала. Зависит от взаимодействия вещества с неподвижной фазой и скорости подвижной фазы.
3. Капацитивный коэффициент (k) Отражает степень удерживания вещества на колонке, определяется отношением времени нахождения вещества в неподвижной фазе к времени нахождения в подвижной фазе.
4. Эффективность колонки (N) Количество теоретических тарелок, характеризующее способность колонки к разделению смеси. Чем больше N, тем выше эффективность колонки.
5. Формула ван-де-Мерва Позволяет количественно оценивать влияние диффузии, линейной скорости подвижной фазы и взаимодействия с фазой на эффективность колонки:
$$ H = A + \frac{B}{u} + C \cdot u $$
где H — высота теоретической тарелки, u — линейная скорость подвижной фазы, A — эффект множества потоков, B — диффузионный вклад, C — сопротивление переносу вещества между фазами.
1. Адсорбция Молекулы компонента временно связываются с поверхностью неподвижной фазы. Степень адсорбции определяется химической природой вещества и полярностью фаз.
2. Распределение между фазами Молекулы равномерно распределяются между подвижной и неподвижной фазой в зависимости от коэффициента распределения. Этот процесс контролирует скорость прохождения компонентов через систему.
3. Ионные взаимодействия Электростатическое притяжение или отталкивание ионов к заряженным группам на поверхности колонки определяет селективное удержание ионов.
4. Молекулярное просеивание Физическое разделение на основе размеров молекул: большие молекулы обходят поры геля и проходят быстрее, мелкие задерживаются внутри пор.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и газовая хроматография с высоким разрешением используют микро- и наноколонки, модифицированные неподвижные фазы, что позволяет значительно ускорить анализ и повысить чувствительность. Ионообменная и гель-проникающая хроматография активно применяется в биохимии и молекулярной биологии для разделения макромолекул, пептидов и белковых комплексов. Новые подходы включают также сверхкритическую флюидную хроматографию, которая расширяет область применимости на термолабильные и труднорастворимые вещества.