Теоретические основы электрофореза

Электрофорез представляет собой метод разделения ионных и полярных молекул в электрическом поле на основе различий их электрофоретической подвижности. Электрофоретическая подвижность (μ) определяется как скорость движения частицы (v) под воздействием электрического поля (E):

$$ \mu = \frac{v}{E} $$

Она зависит от заряда частицы q, размера и формы молекулы, а также вязкости среды η:

$$ \mu = \frac{q}{6 \pi \eta r} $$

где r — радиус сферической частицы. Для макромолекул, таких как белки и нуклеиновые кислоты, учитывается также форма и гидродинамический радиус.

Электрофоретическая подвижность определяется балансом двух сил: электрической силы, направленной вдоль электрического поля, и силы трения, обусловленной сопротивлением среды. В растворе ионы или заряженные молекулы достигают установившейся скорости, когда эти силы уравновешиваются.

Влияние среды на процесс

Раствор, используемый в электрофорезе, оказывает значительное влияние на эффективность разделения. Основные параметры среды:

  • pH: влияет на заряд молекул, особенно аминокислот, белков и нуклеиновых кислот, через протонирование или депротонирование функциональных групп.
  • Ионная сила буфера: определяет степень экранирования зарядов и, следовательно, электрофоретическую подвижность. Высокая ионная сила уменьшает подвижность частиц.
  • Температура: повышение температуры снижает вязкость среды, увеличивая скорость движения, но может вызывать денатурацию белков.

Использование различных буферов позволяет контролировать величину и направление заряда биомолекул, обеспечивая их селективное разделение.

Типы электрофореза

Капиллярный электрофорез (КЭ)

Капиллярный электрофорез основан на движении частиц в узком капилляре под действием электрического поля. Основные характеристики КЭ:

  • Высокая разрешающая способность благодаря малому диаметру капилляра.
  • Электроосмотический поток (EOF), возникающий при заряженных стенках капилляра, способствует движению растворителя и частиц.
  • Возможность разделения широкого спектра молекул: ионов, белков, пептидов, нуклеиновых кислот.

Электрофоретическая подвижность в КЭ складывается из подвижности частицы и скорости EOF, что позволяет тонко регулировать условия разделения.

Гель-электрофорез

Гель-электрофорез осуществляется в пористой среде (например, агарозе или полиакриламиде), что создаёт эффект молекулярного сита:

  • Более крупные молекулы двигаются медленнее, меньшие — быстрее, обеспечивая разделение по размеру и заряду одновременно.
  • Тип геля и его концентрация определяют поры и, соответственно, диапазон молекул, пригодных для анализа.
  • Используется для анализа белков (с SDS или без него), ДНК, РНК и полисахаридов.

Электрофорез в свободном растворе

Разделение молекул в растворе без геля возможно для частиц с различной зарядовой плотностью. Применяется реже из-за ограниченной разрешающей способности, но обеспечивает быстрое разделение и минимальное взаимодействие с матрицей.

Влияние заряда и формы молекулы

  • Протонные состояния функциональных групп определяют общий заряд молекулы, что особенно важно для белков с множеством аминокислотных остатков.
  • Форма молекулы влияет на гидродинамическое сопротивление. Линейные или разветвлённые молекулы испытывают большее трение, чем компактные.
  • Для нуклеиновых кислот, имеющих однородный отрицательный заряд на фосфатной цепи, движение в геле практически не зависит от последовательности, а определяется длиной фрагмента.

Теоретические модели движения частиц

  1. Модель Стокса–Эйнштейна: используется для оценки подвижности сферических частиц в вязкой среде.
  2. Модель Хенри: учитывает электростатическое экранирование в растворах с различной ионной силой.
  3. Молекулярное сито в геле: пористая структура создаёт дополнительное сопротивление, что моделируется через скорость движения относительно размера молекулы.

Детектирование и количественный анализ

Электрофоретические методы позволяют не только разделять, но и количественно определять компоненты:

  • Ультрафиолетовая и видимая спектроскопия: измерение поглощения молекул в потоке.
  • Флуоресцентные метки: повышение чувствительности анализа.
  • Системы с амперометрическим или масс-спектрометрическим детектированием: дают возможность точного количественного анализа и идентификации молекул.

Факторы, влияющие на разрешающую способность

  • Напряжённость электрического поля: более высокое поле увеличивает скорость разделения, но может усиливать диффузию.
  • Длина пути разделения: длинные пути повышают разрешающую способность, но увеличивают время анализа.
  • Буферная система и вязкость: оптимизация условий позволяет минимизировать банд-броаденинг и увеличить точность измерений.

Электрофорез как аналитический метод сочетает физико-химические принципы движения заряженных молекул с практическими подходами контроля среды и условий разделения, что делает его незаменимым инструментом в химии, биохимии и молекулярной биологии.

Оглавление