Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) представляет собой высокоэффективный электрофоретический метод разделения белков и других амфолитов, основанный на их различиях в изоэлектрической точке (pI). Каждая молекула белка содержит кислотные и основные функциональные группы, которые в водной среде могут быть ионизированы. При определённом значении pH, называемом изоэлектрической точкой, суммарный заряд молекулы равен нулю. Именно это свойство лежит в основе принципа фокусирования: молекулы мигрируют в электрическом поле до тех пор, пока не достигнут зоны с pH, соответствующего их pI, где их движение прекращается.
Формирование устойчивого градиента pH осуществляется с использованием специальных амфолитных смесей, распределяющихся под действием электрического поля в капилляре, геле или другой электрофоретической системе. Благодаря этому достигается разделение молекул с высокой разрешающей способностью, превосходящей большинство классических методов электрофореза.
Буферные системы и амфолиты. Для создания стабильного pH-градиента применяются узко- или широкодиапазонные амфолиты. Их концентрация и диапазон pH выбираются исходя из предполагаемого интервала изоэлектрических точек исследуемых соединений. В случае белков обычно используют градиенты в пределах pH 3–10, а для специализированных задач применяют узкие диапазоны (например, pH 4,5–5,5) для более точного разрешения близких по pI молекул.
Электрофоретическая ячейка. Изоэлектрическое фокусирование проводится в капиллярных системах, полиакриламидных гелях или специальных плоских носителях. В геле создаётся стабильный pH-градиент, а молекулы мигрируют до положения равновесия. В капиллярном формате дополнительно используется контроль температуры и детекция в ультрафиолетовой области для количественного анализа.
Процесс разделения. При подаче высокого напряжения амфолиты распределяются по длине носителя, формируя градиент pH. Аналитические молекулы начинают мигрировать к аноду или катоду в зависимости от их начального заряда, но как только они достигают области с pH = pI, их электрофоретическая подвижность обнуляется. Возникает эффект фокусирования: все молекулы данного вида концентрируются в узкой зоне.
Протеомика. ИЭФ является ключевым методом для изучения белкового состава клеток и тканей, позволяя детектировать изоформы белков, различающиеся посттрансляционными модификациями.
Клиническая диагностика. Метод используется для выявления патологических изменений белковых профилей в крови, спинномозговой жидкости и других биологических средах. Особое значение он имеет при диагностике множественной миеломы, болезней печени и наследственных метаболических нарушений.
Биотехнология и фармацевтика. ИЭФ применяется для контроля чистоты белковых препаратов, определения гетерогенности рекомбинантных белков и оценки стабильности лекарственных форм.
Исследования ферментов. Благодаря высокой точности разделения метод позволяет изучать ферментные изоферменты, важные для понимания метаболических процессов.
Современные исследования сосредоточены на миниатюризации изоэлектрического фокусирования и интеграции его в микрофлюидные платформы. Перспективным является сочетание ИЭФ с масс-спектрометрией для прямой идентификации белков и их модификаций. Разрабатываются новые амфолитные смеси, позволяющие формировать ультраузкие градиенты pH, а также системы автоматического управления процессом, повышающие точность и воспроизводимость анализа.