Капиллярный электрофорез

Капиллярный электрофорез (КЭ) представляет собой аналитический метод разделения ионов и полярных молекул под действием электрического поля в узком капилляре. Разделение основано на различиях электрофоретической подвижности частиц, которая определяется их зарядом, размером и формой. Метод сочетает высокую разрешающую способность с малыми объёмами образца и быстрым временем анализа.

Ключевым элементом КЭ является узкий капилляр, обычно изготавливаемый из силикатного стекла, диаметр которого варьируется от 25 до 100 мкм. Длина капилляра может достигать 50–100 см, что обеспечивает достаточное пространство для эффективного разделения. Электрическое поле создаётся приложением напряжения от 10 до 30 кВ между электродами на концах капилляра.

Электрофоретическая подвижность и факторы, влияющие на неё

Электрофоретическая подвижность (_{ep}) определяется формулой:

[ _{ep} = ]

где:

    1. — заряд иона,
  • () — вязкость среды,
    1. — гидратированный радиус частицы.

С увеличением заряда или уменьшением размера частицы электрофоретическая подвижность возрастает. Влияние pH и ионной силы буфера особенно важно при разделении аминокислот, пептидов и других биомолекул, так как изменение степени протонирования модифицирует заряд молекулы.

Основные режимы капиллярного электрофореза

  1. Классический капиллярный электрофорез (CZE) Разделение происходит за счёт различий в зарядовой плотности и гидратированном радиусе. Частицы двигаются со скоростью, пропорциональной их электрофоретической подвижности. CZE обеспечивает высокую разрешающую способность для ионов с одинаковой химической природой, но различным зарядом.

  2. Капиллярный электрофорез в микроджеле (CGE) Используется для разделения макромолекул, таких как белки и олигосахариды, с помощью капилляров, заполненных гелем. Гель создаёт препятствия для диффузии, усиливая эффект молекулярного Sieving.

  3. Капиллярный изоэлектрический фокусинг (CIEF) Разделение основано на различии изоэлектрических точек белков и пептидов. Под действием градиента pH молекулы мигрируют до тех пор, пока их заряд не станет равен нулю, концентрируясь в узких зонах.

  4. Микроконвективный и капиллярный электрофорез с мицеллярной фазой (MEKC) Позволяет разделять нейтральные молекулы за счёт взаимодействия с мицеллами в буфере. Молекулы, диффундируя между мицеллами и буфером, демонстрируют различную эффективную подвижность.

Хиральное разделение в капиллярном электрофорезе

Хиральный капиллярный электрофорез (CE) используется для разделения энантиомеров, которые имеют идентичные физико-химические свойства, но различаются в взаимодействии с хиральными селективными агентами.

Принципы хирального CE:

  • Введение хирального модификатора в буфер, например, циклодекстринов, позволяющего образовывать комплексы с одним из энантиомеров.
  • Различие в стабильности комплексов вызывает различную электрофоретическую подвижность энантиомеров, обеспечивая их эффективное разделение.

КЭ хирального типа широко применяется в фармацевтике для контроля энантиомерного состава лекарственных средств, так как активность многих соединений сильно зависит от стереохимии.

Детектирование и количественный анализ

Для регистрации разделённых компонентов применяются различные методы:

  • Ультрафиолетовое (UV) поглощение, наиболее универсальное для органических и биологических молекул.
  • Флуоресценция, обладающая высокой чувствительностью, используется для меток или природных флуоресцирующих групп.
  • Масс-спектрометрия (CE-MS), обеспечивающая структурную идентификацию и количественный анализ с высоким разрешением.

Преимущества и ограничения метода

Преимущества:

  • Высокое разрешение (до нескольких тысяч теоретических тарелок).
  • Минимальный расход растворителей и образцов (нанолитровые объёмы).
  • Возможность анализа широкого спектра соединений — от малых ионов до белков и полисахаридов.
  • Лёгкость модификации буфера и добавок для специфического разделения.

Ограничения:

  • Низкая чувствительность без флуоресцентного или масс-спектрометрического детектирования.
  • Необходимость строгого контроля pH и температуры для стабильности электрофоретической подвижности.
  • Ограничения при анализе очень больших макромолекул из-за медленной диффузии и высоких вязкостей гелей.

Применение в стереохимическом анализе

Капиллярный электрофорез особенно ценен для стереохимического анализа:

  • Разделение дискретных энантиомеров и диастереомеров.
  • Контроль конверсии и селективности в асимметричных синтезах.
  • Анализ природных и синтетических аминокислот, пептидов, сахаров с сохранением их хиральной информации.

В сочетании с масс-спектрометрией и хиральными буферами КЭ позволяет получать точные количественные данные о распределении стереоизомеров даже в сложных биологических и фармацевтических матрицах.

Капиллярный электрофорез представляет собой универсальный инструмент современной аналитической химии, объединяя высокую селективность, малый расход реагентов и возможность точного стереохимического контроля, что делает его незаменимым методом для фундаментальных и прикладных исследований.

Оглавление