Спектрофотометрические методы анализа

Спектрофотометрия представляет собой метод количественного и качественного анализа веществ на основе измерения поглощения или пропускания света определённой длины волны веществом. Основным физическим принципом является закон Бера–Ламберта–Бугера, который устанавливает прямую зависимость между концентрацией вещества и степенью поглощения света:

[ A = _{10} = , c , l]

где (A) — оптическая плотность, (I_0) и (I) — интенсивности падающего и прошедшего света, () — молярный коэффициент экстинкции, (c) — концентрация вещества, (l) — длина кюветы.

Ключевыми компонентами спектрофотометрической системы являются:

  • Источник света (обычно лампы Де-Марая, галогенные или светодиодные источники)
  • Монохроматор для выделения определённой длины волны
  • Кювета с анализируемым раствором
  • Детектор, регистрирующий интенсивность прошедшего света

Классификация спектрофотометрических методов

  1. Ультрафиолетовая и видимая спектрофотометрия (UV-Vis) Основана на поглощении света в диапазоне 190–800 нм. Широко используется для анализа органических соединений, лекарственных препаратов и биомолекул (белков, нуклеиновых кислот).

  2. Инфракрасная спектрофотометрия (IR) Используется для исследования функциональных групп и структурных особенностей молекул. Поглощение происходит в диапазоне 2,5–25 мкм, что соответствует колебательным переходам химических связей.

  3. Флуоресцентная спектрофотометрия Основана на способности вещества испускать свет при возбуждении определённой длиной волны. Метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью, часто применяется для анализа микроэлементов и биомолекул в малых концентрациях.

  4. Атомная спектрофотометрия Включает методы атомной абсорбции (AAS) и атомной эмиссии (AES). Позволяет количественно определять элементы в микро- и наноконцентрациях.

Методические аспекты и подготовка проб

Качество спектрофотометрического анализа напрямую зависит от подготовки проб. Основные этапы включают:

  • Разбавление и стандартизацию растворов
  • Использование соответствующих растворителей, не поглощающих исследуемую длину волны
  • Очистку проб от посторонних веществ (фильтрация, центрифугирование)
  • Поддержание постоянной температуры и pH для стабилизации химических форм анализируемого вещества

Калибровка и построение градуировочных кривых

Для количественного анализа обязательна калибровка прибора с использованием стандартных растворов. Градуировочная кривая строится по зависимости (A) от (c). Линейный участок кривой используется для точного определения концентрации неизвестного образца.

Ключевые принципы построения градуировочных кривых:

  • Диапазон концентраций выбирается так, чтобы соблюдался закон Бера–Ламберта
  • Для снижения систематических ошибок проводят многократные измерения
  • Использование внутренних стандартов повышает точность анализа

Применение в медицинской химии

Спектрофотометрические методы имеют критическое значение для анализа биологических жидкостей, лекарственных веществ и метаболитов:

  • Определение белков и ферментов: абсорбция при 280 нм используется для количественной оценки белков; каталитические активности ферментов определяют через изменение поглощения субстрата или продукта.
  • Анализ нуклеиновых кислот: спектрофотометрия при 260 нм позволяет оценить концентрацию и чистоту ДНК/РНК.
  • Мониторинг микроэлементов и токсинов: атомная абсорбция применяется для анализа железа, меди, свинца и кадмия в биологических средах.
  • Контроль фармацевтических препаратов: измерение спектра поглощения активного вещества и сравнение с эталонными стандартами обеспечивает точность дозировки.

Преимущества и ограничения

Преимущества:

  • Высокая точность и воспроизводимость
  • Возможность анализа малых объёмов и концентраций
  • Относительная простота аппаратуры и методики

Ограничения:

  • Наличие интерференции от посторонних веществ
  • Необходимость прозрачных растворов
  • Линейность закона Бера–Ламберта ограничена определённым диапазоном концентраций

Спектрофотометрические методы остаются основой аналитической химии в медицинских исследованиях благодаря сочетанию высокой чувствительности, специфичности и возможности количественного контроля широкого спектра химических и биохимических соединений.

Оглавление