Хроматография является одним из основных инструментов для разделения белков по различным физико-химическим свойствам. Выделяют несколько основных типов:
Гель-фильтрационная хроматография – разделение белков по молекулярной массе. Молекулы проходят через пористый матрикс, где крупные молекулы элюируются быстрее, а малые задерживаются в порах. Этот метод позволяет оценивать агрегатное состояние белков и изучать их олигомеризацию.
Ионообменная хроматография – основана на различии зарядов белковых молекул. Белки с противоположным зарядом к зарядной группе сорбента удерживаются дольше, что позволяет выделять фракции с высокой степенью чистоты.
Аффинная хроматография – использует специфическое связывание белка с лигандами, закреплёнными на твердой фазе. Применяется для выделения ферментов, рецепторов и антител с высокой специфичностью.
Гидрофобная хроматография – разделение белков по гидрофобности поверхности, что позволяет изучать структурные изменения и денатурацию.
Электрофорез позволяет разделять белки в электрическом поле на основе их заряда, размера и формы:
Полиакриламидный гель с денатурирующим агентом (SDS-PAGE) – белки денатурируются и приобретают отрицательный заряд пропорционально молекулярной массе, что обеспечивает высокую точность определения массы молекул.
Изоэлектрическое фокусирование – белки мигрируют в градиенте pH до точки, где их суммарный заряд равен нулю. Этот метод эффективен для разделения белков с близкими молекулярными массами, но различающимися изоэлектрическими точками.
Двумерный электрофорез – комбинация изоэлектрического фокусирования и SDS-PAGE. Позволяет одновременно учитывать массу и заряд, что обеспечивает высокую разрешающую способность при изучении сложных белковых смесей.
Спектроскопия позволяет получать информацию о структуре, конформации и взаимодействиях белков:
Ультрафиолетовая спектроскопия (UV-Vis) – измеряет поглощение света белками в области 280 нм, обусловленное ароматическими аминокислотами (триптофан, тирозин, фенилаланин). Используется для количественного анализа белков.
Флуоресцентная спектроскопия – основана на естественной флуоресценции триптофана или введенных флуоресцентных меток. Позволяет отслеживать конформационные изменения и взаимодействие с лигандами.
Круговой дихроизм (CD) – чувствителен к вторичной структуре белка. Альфа-спирали и бета-листы имеют характерные спектральные сигнатуры, что позволяет оценивать структуру в растворе.
ЯМР-спектроскопия – предоставляет атомное разрешение информации о структуре и динамике белка в растворе. Применяется для исследования малых и средних белков, изучения конформационных изменений и взаимодействий с молекулами.
Раман-спектроскопия – используется для изучения вторичной структуры и локальной среды аминокислотных остатков. Чувствительна к изменениям конформации и взаимодействиям с растворителем.
Мас-спектрометрия позволяет определять молекулярную массу белков и состав пептидов:
MALDI-TOF – мягкий ионизационный метод, обеспечивающий точное определение массы белков и пептидов. Используется для идентификации белков в сложных смесях.
ESI-MS (Electrospray Ionization Mass Spectrometry) – позволяет анализировать не только массу, но и структуру белков, а также их комплексы с лигандами. Применяется для изучения посттрансляционных модификаций.
Рентгеноструктурный анализ – позволяет определить трёхмерную атомную структуру белков с высоким разрешением. Требует получения высококачественных кристаллов и позволяет изучать активные центры ферментов, взаимодействие с лигандами и конформационные изменения.
Крио-электронная микроскопия (cryo-EM) – современный метод визуализации белковых комплексов вблизи нативного состояния без необходимости кристаллизации. Подходит для изучения больших белковых комплексов и мембранных белков.
AFM (атомно-силовая микроскопия) – обеспечивает визуализацию поверхности белковых молекул и изучение их механических свойств.
Ферментативные и связывающие анализы – позволяют изучать активность белков, кинетику ферментов, а также взаимодействие с лигандами или другими белками. К ним относятся методы спектрофотометрии, флуоресцентного зонда, радиометрии.
Вестерн-блоттинг – используется для идентификации конкретных белков в сложных смесях с помощью специфических антител. Обеспечивает высокую селективность и чувствительность.
Иммуноцитохимия и иммунофлуоресценция – позволяют локализовать белки в клетках и тканях, изучать их распределение и динамику.
Генетическое кодирование белков с метками – GFP и другие флуоресцентные белки позволяют отслеживать экспрессию, локализацию и динамику белков in vivo.
Мутагенез и site-directed mutagenesis – используются для изучения функции отдельных аминокислотных остатков, активных центров ферментов и доменов белков.
Протеомные подходы – комплексные методы, включающие масс-спектрометрию, двухмерный электрофорез и биоинформатический анализ для идентификации и количественного изучения белков в клетках и тканях.
Эти методы в совокупности создают многопрофильный подход к изучению белков, обеспечивая понимание их структуры, функций, взаимодействий и динамики на молекулярном уровне.