Классификация методов
анализа
Анализ нуклеиновых кислот включает физико-химические, химические и
биохимические подходы, направленные на выявление структуры,
концентрации, чистоты и функциональной активности ДНК и РНК. Методы
анализа делятся на:
- Качественные, позволяющие определить наличие
нуклеиновых кислот в пробе.
- Количественные, обеспечивающие измерение
концентрации и молекулярной массы.
- Структурные, направленные на определение
нуклеотидного состава, последовательности и вторичной структуры.
- Функциональные, оценивающие способность нуклеиновой
кислоты к гибридизации, транскрипции или каталитической активности.
Спектрофотометрический
анализ
Одним из основных методов количественного анализа нуклеиновых кислот
является спектрофотометрия в ультрафиолетовой области (260 нм), где
молекулы нуклеиновых кислот поглощают свет за счет ароматических
оснований. Ключевые особенности:
- Определение концентрации по закону Бэра–Ламберта:
(A = c l), где (A) — оптическая плотность, () — молярный коэффициент
поглощения, (c) — концентрация, (l) — длина кюветы.
- Оценка чистоты с использованием отношения
(A_{260}/A_{280}); значения около 1,8–2,0 свидетельствуют о высокой
чистоте ДНК и РНК, при снижении возможна примесь белков.
- Спектрофотометрия при 230 нм позволяет выявить
загрязнения фенолом или солью.
Электрофоретические методы
Электрофорез — метод разделения нуклеиновых кислот по размеру и
заряду. Основные формы:
- Гель-электрофорез в агарозе используется для
разделения фрагментов ДНК и РНК длиной от сотен до десятков тысяч
нуклеотидов. Степень миграции зависит от размера молекул.
- Полиакриламидный гель позволяет разрешать короткие
олигонуклеотиды (от 5 до 500 нуклеотидов) с высоким разрешением.
- Не denaturing и denaturing режимы: в денатурирующих
гелях (с формамидом или мочевиной) РНК удерживается в развернутой форме,
что предотвращает образование вторичной структуры.
Электрофорез также используется для выявления конформационных
изменений, слияний и деградации молекул.
Хроматографические методы
- Вещество-хроматография на основе обмена ионных
групп применяется для разделения олигонуклеотидов и
мононуклеотидов по заряду.
- Обратная фазовая жидкостная хроматография
эффективна для анализа гидрофобных модификаций оснований.
- Гель-проникающая хроматография используется для
выделения молекул определенной молекулярной массы.
- Высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC)
обеспечивает точный количественный и качественный анализ, включая
выявление редких нуклеотидов и модифицированных оснований.
Флуоресцентные методы
Флуоресцентные красители, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами,
позволяют повысить чувствительность анализа:
- Этидиум бромид и SYBR Green
используются для визуализации ДНК и РНК в гелях.
- Флуоресцентные зонды и метки применяются для
количественного анализа и отслеживания гибридизации.
- Флуоресцентная спектроскопия позволяет изучать
конформацию молекул и взаимодействие с белками.
Мас-спектрометрия
Масс-спектрометрия обеспечивает определение молекулярной массы
нуклеиновых кислот и их фрагментов:
- MALDI-TOF и ESI-MS применяются для анализа
олигонуклеотидов и небольших РНК.
- Позволяет выявлять химические модификации оснований и длину
фрагментов.
- Используется в сочетании с хроматографическими методами для более
точного анализа сложных смесей.
Гибридизационные методы
- Северный и Южный блоттинг позволяют
идентифицировать специфические последовательности РНК и ДНК
соответственно.
- Микроматрицы ДНК обеспечивают высокопараллельный
анализ экспрессии генов и обнаружение полиморфизмов.
- Флуоресцентные зонды (например, молекулы типа FISH)
применяются для локализации последовательностей в клетке.
Физико-химические методы
- ЯМР-спектроскопия используется для изучения
структуры олигонуклеотидов, конформационных изменений и взаимодействий с
лигандом.
- Рентгеноструктурный анализ обеспечивает трехмерное
разрешение молекул ДНК и РНК.
- Калориметрия (дифференциальная сканирующая
калориметрия) позволяет исследовать термостабильность двойной спирали и
термодинамику гибридизации.
Биохимические методы
- Ферментативный анализ: использование нуклеаз и
полимераз позволяет изучать последовательность и структуру.
- Полимеразная цепная реакция (PCR) применяется для
амплификации и количественного анализа специфических
последовательностей.
- Обратная транскрипция и кДНК-синтез позволяют
оценивать экспрессию генов на уровне РНК.
Современные интегрированные
подходы
Комплексные методы включают комбинацию электрофореза, флуоресценции,
масс-спектрометрии и микроматриц для детального анализа структуры,
количества и функций нуклеиновых кислот. Современные технологии
позволяют не только количественно оценивать молекулы, но и изучать их
взаимодействие с белками, малой РНК и лекарственными агентами,
обеспечивая полное понимание биологических процессов.