Флуоресцентная спектроскопия является методом анализа молекул, основанным на изучении их способности поглощать свет в ультрафиолетовом или видимом диапазоне и последующем излучении фотонов с большей длиной волны. Этот процесс отражает переход молекул из основного состояния в возбужденное и обратно с испусканием энергии, что позволяет получать качественную и количественную информацию о химических веществах.
Флуоресценция отличается от фосфоресценции временем жизни возбужденного состояния: флуоресценция проявляется на наносекундном временном интервале, тогда как фосфоресценция — на микросекундном и более длительном.
Основой флуоресцентной спектроскопии служат энергетические уровни молекул. При поглощении фотона молекула переходит из основного состояния S₀ в возбужденное синглетное состояние S₁ или S₂. Затем молекула теряет часть энергии через внутреннюю конверсию и вибрационное расслабление, после чего возвращается в основное состояние, испуская фотон с меньшей энергией. Этот эффект приводит к стоксовому сдвигу, когда длина волны эмиссии превышает длину волны поглощения.
Диаграммы Джабло (Jablonski diagrams) наглядно отображают процессы поглощения, испускания и нерадиационных переходов: внутреннюю конверсию, межсистемное пересечение и квантовую эффективность флуоресценции.
Квантовый выход (Φ) определяется как отношение числа фотонов, испущенных молекулой, к числу поглощенных фотонов. Он зависит от молекулярной структуры, растворителя, температуры и наличия коллизионных квасипоглотителей. Высокий квантовый выход характеризует яркую флуоресценцию, низкий — слабую.
Интенсивность флуоресценции (I_f) описывается уравнением:
[ I_f = k I_0 (1 - 10^{-A})]
где (k) — коэффициент, зависящий от спектрометра, (I_0) — интенсивность падающего света, (A) — оптическая плотность образца. В разбавленных растворах зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации почти линейна, что позволяет использовать методику для количественного анализа.
Флуоресцентные свойства молекул сильно зависят от окружающей среды. Полярность растворителя, pH, наличие ионов и кислорода может изменять спектр эмиссии и квантовый выход. Например, кислород служит эффективным коллизионным поглотителем энергии возбужденного состояния, вызывая квенецию флуоресценции. Связь молекул с белками или липидными мембранами может приводить к сдвигу спектра и изменению интенсивности.
Для регистрации флуоресценции используют спектрофотометры, оборудованные источником света (обычно ксеноновая лампа или лазер), монохроматорами для выбора длины волны возбуждения и эмиссии, фотодетекторами и электронными усилителями. Время интеграции сигнала позволяет измерять как steady-state флуоресценцию, так и временные характеристики (time-resolved fluorescence).
Флуоресцентная спектроскопия в растворах требует разбавления до оптических плотностей менее 0,1 для исключения эффекта самопоглощения. В твёрдых средах и пленках используют фронтальное освещение или интегральные сферы для сбора излучения.
Метод применяется для:
Развитие лазерной техники позволило внедрить флуоресценцию с разрешением по времени, где анализируют динамику возвращения молекул в основное состояние. Флуоресцентная микроскопия и конфокальная флуоресцентная спектроскопия дают пространственное разрешение на уровне клеток и субклеточных структур. Методы мультиплексирования и использование флуорофоров с различными спектрами эмиссии позволяют одновременно отслеживать несколько процессов.
Флуоресцентная спектроскопия продолжает расширять границы аналитической химии, биохимии и материаловедения, обеспечивая высокую чувствительность, селективность и широкие возможности для изучения динамики молекулярных систем.