Спектроскопические методы основаны на взаимодействии электромагнитного излучения с веществом и анализе возникающих спектров. В основе лежит поглощение, испускание или рассеяние света молекулами, что позволяет судить о структуре, составе, концентрации и физико-химических свойствах исследуемых веществ. Каждый вид спектроскопии характеризуется своим диапазоном длин волн и типом взаимодействия, что определяет получаемую информацию о молекулярных параметрах.
Спектр отражает энергетические уровни атомов и молекул. Различные типы спектров — электронные, колебательные, вращательные — возникают при переходах между уровнями разной природы. В биохимии спектроскопия используется для анализа белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов и метаболитов, позволяя исследовать их структуру, динамику и функциональные состояния.
Принцип метода. УФ-ВИД-спектроскопия основана на поглощении света в диапазоне 200–800 нм. Поглощение связано с электронными переходами, происходящими при возбуждении π- или n-электронов молекул. В биохимии этот метод применяется для количественного определения соединений, содержащих сопряжённые двойные связи и ароматические хромофоры.
Применение.
Спектры поглощения. Каждый тип молекулы имеет характерный максимум поглощения, зависящий от электронной структуры. Соотношение между поглощением при различных длинах волн позволяет судить о чистоте образца, взаимодействиях белок–нуклеиновая кислота, о конформационных изменениях макромолекул.
Принцип. ИК-спектроскопия исследует колебательные переходы молекул, возникающие при поглощении инфракрасного излучения в диапазоне 4000–400 см⁻¹. Каждая химическая связь имеет характерную частоту колебаний, зависящую от массы атомов и силы связи.
Характеристика спектров.
Применение. ИК-спектроскопия используется для идентификации функциональных групп, исследования белковых конформаций, изучения водородных связей и степени гидратации макромолекул. С помощью Фурье-преобразовательной ИК-спектроскопии (Фурье-ИК) возможно получение спектров с высоким разрешением и регистрация изменений в динамических процессах.
Принцип. Рамановское рассеяние возникает при неупругом взаимодействии света с молекулой, когда изменяется энергия фотона вследствие возбуждения или релаксации колебательных уровней. Спектр комбинационного рассеяния отражает колебательные моды, аналогичные ИК-спектру, но с иной селективностью.
Особенности.
Биохимические применения. Используется для изучения структурных изменений белков, липидных мембран, нуклеиновых кислот, а также для анализа внутриклеточных компонентов без разрушения клетки. Современные методы — резонансная и поверхностно-усиленная рамоновская спектроскопия (SERS) — обеспечивают чувствительность до уровня отдельных молекул.
Принцип. ЯМР основан на взаимодействии магнитных моментов ядер с внешним магнитным полем и электромагнитным излучением радиодиапазона. При определённой частоте происходит резонансное поглощение энергии, зависящее от химического окружения атома.
Параметры спектра.
Применение в биохимии. ЯМР-спектроскопия незаменима для определения пространственной структуры белков и нуклеиновых кислот в растворе, анализа динамики конформационных переходов, исследования метаболических процессов in vivo. Методы двух- и многомерного ЯМР (COSY, NOESY, HSQC) обеспечивают детальное картирование внутримолекулярных взаимодействий.
Принцип. ЭПР основан на резонансном поглощении микроволнового излучения неспаренными электронами в магнитном поле. Метод применим к веществам, содержащим свободные радикалы или переходные металлы с неполными d- или f-оболочками.
Биохимическое значение. ЭПР используется для изучения структуры и функций металлопротеинов (гемоглобина, цитохромов, ферритина), определения локализации и динамики свободных радикалов, регистрации промежуточных продуктов окислительно-восстановительных реакций. Метод позволяет исследовать процессы окислительного стресса, антиоксидантную активность и стабильность биомолекул.
Принцип. Флуоресценция возникает при возвращении возбужденной молекулы в основное состояние с испусканием фотона. Интенсивность, спектр и время жизни флуоресценции зависят от микросреды молекулы, что делает метод высокочувствительным к структурным и динамическим изменениям.
Применение.
Флуоресцентная спектроскопия отличается высокой чувствительностью и позволяет анализировать концентрации на уровне наномоляр.
Принцип. Метод основан на поглощении атомами света определённой длины волны, соответствующей переходам между энергетическими уровнями атома. При прохождении света через атомный пар наблюдается ослабление интенсивности излучения.
Использование в биохимии. Атомно-абсорбционная спектроскопия применяется для количественного определения микроэлементов — железа, меди, цинка, магния, кальция и других, входящих в состав ферментов и белков. Точность и чувствительность метода делают его незаменимым при анализе элементного состава биологических тканей и жидкостей.
Принцип. Масспектроскопия (масспектрометрия) исследует ионы, образующиеся при ионизации вещества, по их отношению массы к заряду (m/z). Разделение и регистрация ионов позволяют определять молекулярную массу и структуру соединений.
Применение. В биохимии метод используется для определения аминокислотных последовательностей белков, идентификации пептидов, анализа посттрансляционных модификаций, метаболомных профилей и изотопных меток. Современные методы ионизации — электрораспылительная (ESI) и матрично-активированная лазерная десорбция (MALDI) — позволяют анализировать крупные биомолекулы без разрушения.
Спектроскопические методы представляют собой фундаментальный инструмент биохимических исследований, обеспечивая качественный и количественный анализ веществ на всех уровнях организации биомолекул. Их сочетание позволяет получать многомерную информацию о структуре, функциях и динамике биологических систем, что делает спектроскопию неотъемлемой частью современной химии и молекулярной биологии.