Спектроскопия ультрафиолетового (УФ) излучения является одним из основных инструментов для анализа нуклеиновых кислот. ДНК и РНК обладают характерным поглощением в диапазоне 260 нм за счёт ароматических оснований. Изменения УФ-спектра при нагревании (гиперхромный эффект) позволяют оценивать процессы денатурации и ренатурации, стабильность двойной спирали и её температурный коэффициент плавления (Tm).
Флуоресцентная спектроскопия применяется для исследования структурных изменений и взаимодействий нуклеиновых кислот с лигандами, белками и малым молекулярным соединением. Метки на основе флуоресцеина, родамина и других красителей позволяют проводить анализ конформационных переходов в реальном времени.
Оптическая вращательная спектроскопия (CD, Circular Dichroism) используется для изучения вторичной структуры ДНК и РНК. Различные типы спиралей (B-ДНК, A-ДНК, Z-ДНК) и участки с нарушенной структурой имеют характерные сигналы в циркулярной дихроизменции, что позволяет оценивать конформационные изменения под действием температуры, ионной среды или белковых факторов.
Гель-электрофорез в агарозном и полиакриламидном геле применяется для разделения ДНК и РНК по размеру и конформации. Электрофоретическая подвижность зависит от длины молекулы, её топологии (линейная, кольцевая, суперспиральная ДНК) и степени денатурации. Особое значение имеет двумерный электрофорез, позволяющий одновременно анализировать размер и структуру нуклеиновых кислот.
Капиллярный электрофорез обеспечивает высокую разрешающую способность, позволяя разделять олигонуклеотиды и выявлять модификации оснований. Этот метод часто комбинируется с флуоресцентной детекцией для количественного анализа.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, HPLC) используется для разделения нуклеотидов, нуклеозидов и олигонуклеотидов. Метод основан на различной полярности, ионном заряде и гидрофобности молекул. Особое значение имеет ионно-обменная ВЭЖХ для анализа состава и соотношения оснований в полинуклеотидных цепях.
Гель-фильтрационная хроматография позволяет разделять макромолекулы по молекулярной массе, определять конформацию и степень агрегации нуклеиновых кислот.
Масс-спектрометрия (MS) применяется для точного определения массы олигонуклеотидов и их модификаций. Методы MALDI-TOF и ESI-MS позволяют идентифицировать концевые модификации, включение нестандартных оснований и химические метки. Совмещение с жидкостной хроматографией (LC-MS) обеспечивает высокую точность анализа сложных смесей нуклеиновых кислот.
Классическое химическое и ферментативное секвенирование основано на специфическом разрыве цепи или инкорпорации меток в процессе полимеризации. ДНК-секвенирование методом Сэнгера до сих пор используется для коротких участков и точного анализа последовательности.
Современные высокопроизводительные технологии (NGS, Next Generation Sequencing) обеспечивают массовое параллельное считывание миллионов фрагментов ДНК или РНК. Эти методы позволяют анализировать полные геномы, транскриптомы и выявлять редкие вариации.
Ферментативный анализ включает использование нуклеаз (например, DNase, RNase), лигаз и полимераз для изучения структуры, функциональной активности и модификаций нуклеиновых кислот. Интерес представляют также методы метилрования и ацетилирования, выявляющие эпигенетические модификации.
Гибридизация с метками (радиоактивными, флуоресцентными, биотиновыми) позволяет идентифицировать конкретные последовательности в ДНК или РНК. Методы, такие как Northern, Southern и Western blot, используются для количественного и качественного анализа нуклеиновых кислот и их взаимодействий с белками.
ПЦР и её модификации (RT-PCR, qPCR, цифровая ПЦР) обеспечивают амплификацию и количественный анализ специфических последовательностей. Это позволяет изучать экспрессию генов, мутации и структуру геномного материала с высокой точностью.
Рентгеноструктурный анализ позволяет определить трёхмерную структуру нуклеиновых кислот на атомном уровне, выявить расположение оснований, водородные связи и конформационные особенности.
ЯМР-спектроскопия (NMR) используется для анализа динамики, гибкости и межмолекулярных взаимодействий ДНК и РНК в растворе.
Криоэлектронная микроскопия (Cryo-EM) обеспечивает визуализацию крупных комплексов нуклеиновых кислот с белками и другими макромолекулами, выявляя их пространственную организацию в нативных условиях.
Молекулярное моделирование и динамика позволяют прогнозировать конформацию, стабильность и взаимодействия нуклеиновых кислот.
Секвенсные базы данных и алгоритмы анализа обеспечивают сравнение последовательностей, выявление консервативных мотивов, структурных элементов и возможных функциональных сайтов.
Методы машинного обучения становятся инструментом предсказания вторичной структуры РНК, сайтов связывания белков и оценки последствий мутаций на структуру и функцию нуклеиновых кислот.
Методы изучения нуклеиновых кислот формируют комплексный подход, объединяющий физико-химию, биохимию, молекулярную биологию и вычислительные технологии, обеспечивая глубокое понимание структуры, функции и динамики этих ключевых биополимеров.