Хроматография является фундаментальным инструментом разделения и анализа биомолекул. Она основана на различиях в распределении компонентов между подвижной и неподвижной фазами. Основные разновидности:
Тонкослойная хроматография (ТСХ) — используется для разделения малых молекул, таких как аминокислоты, пептиды и углеводы. Наличие различных адсорбентов (силикагель, алюминий) позволяет варьировать селективность. Основной параметр — (R_f) значение, характеризующее подвижность вещества относительно подвижной фазы.
Жидкостная хроматография высокой эффективности (ВЭЖХ) — применяется для анализа и очистки белков, нуклеотидов, липидов. Основные режимы: обратная фаза, ионообменная и гель-фильтрационная хроматография. Высокое разрешение достигается за счет мелкодисперсных сорбентов и высокого давления.
Газовая хроматография (ГХ) — эффективна для летучих органических соединений, таких как липиды и метаболиты. Часто используется в сочетании с масс-спектрометрией для идентификации компонентов.
Электрофорез позволяет разделять молекулы по заряду и размеру. Ключевые типы:
Гель-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) — оптимален для белков и нуклеиновых кислот. Используются как денатурирующие условия (SDS-PAGE), так и нативные условия, позволяющие сохранять биологическую активность белков.
Агарозный гель-электрофорез — применяется для анализа ДНК и РНК фрагментов. Разрешающая способность зависит от концентрации агарозного геля, которая регулирует размер пор.
Изоэлектрическое фокусирование — разделение белков по их изоэлектрической точке (pI), критически важно для изучения протеомов и посттрансляционных модификаций.
Спектроскопия используется для анализа структуры и концентрации биомолекул. Основные подходы:
УФ/видимая спектроскопия — позволяет определять белки по абсорбции на 280 нм (триптофан, тирозин) и нуклеиновые кислоты на 260 нм. Определение концентрации осуществляется с использованием закона Бугера–Ламберта–Бера.
Флуоресцентная спектроскопия — применяется для изучения взаимодействий биомолекул, изменений конформации белков и локализации в клетке. Флуорофоры могут быть как естественными (триптофан), так и экзогенными (флуоресцентные метки).
ЯМР-спектроскопия — обеспечивает детальную информацию о структуре молекул в растворе, динамике конформаций, взаимодействиях лиганд-белок. Ядра ^1H, ^13C, ^15N широко используются для изучения белков и нуклеиновых кислот.
ИК-спектроскопия и Рамановская спектроскопия — позволяют исследовать химические связи и функциональные группы в молекулах. Часто используются для анализа липидов, углеводов и вторичной структуры белков.
Масс-спектрометрия (МС) является ключевым методом идентификации и количественного анализа биомолекул. Она позволяет определять молекулярную массу с высокой точностью и исследовать посттрансляционные модификации белков. Основные методы и комбинации:
MALDI-TOF — эффективен для анализа белков и пептидов, обеспечивает точное измерение массы и минимальное разрушение молекулы.
ESI-MS — подходит для анализа полимерных и трудно летучих молекул, легко сочетается с жидкостной хроматографией.
MS/MS (тандемная масс-спектрометрия) — используется для расшифровки аминокислотной последовательности белков и идентификации метаболитов.
Современная биохимия активно интегрирует методы молекулярной биологии для анализа биомолекул:
ПЦР и количественная ПЦР (qPCR) — позволяют амплифицировать и количественно анализировать фрагменты ДНК и РНК.
Секвенирование — от классического Сэнгера до высокопроизводительных методов (NGS), обеспечивает детальное изучение геномов и транскриптомов.
Методы гибридизации и микрочипы — используются для анализа экспрессии генов и идентификации последовательностей нуклеиновых кислот.
Изучение взаимодействий и реакционной способности биомолекул невозможно без методов кинетики и термодинамики:
Спектрофотометрическая и флуоресцентная кинетика — позволяет измерять скорость ферментативных реакций и взаимодействий белок-лиганд.
Изотермическое калориметрирование (ITC) — обеспечивает прямое измерение термодинамических параметров взаимодействий, таких как ΔG, ΔH, ΔS.
Поверхностное плазмонное резонансное (SPR) исследование — позволяет изучать ассоциацию и диссоциацию биомолекул в реальном времени без мечения.
Методы, основанные на специфических взаимодействиях антител и антигенов, широко применяются для идентификации и количественного анализа белков:
ELISA — высокочувствительный количественный метод, позволяющий определять низкие концентрации белков и пептидов.
Вестерн-блоттинг — сочетает электрофорез и иммунологическую детекцию, обеспечивая высокую специфичность.
Иммунофлуоресценция и конфокальная микроскопия — позволяют визуализировать локализацию белков в клетках и тканях с высоким пространственным разрешением.
Анализ трёхмерной структуры биомолекул критически важен для понимания их функции:
Рентгеноструктурный анализ (X-ray crystallography) — обеспечивает атомное разрешение структуры белков и нуклеиновых кислот. Требует кристаллизации молекул.
Крио-электронная микроскопия (cryo-EM) — позволяет изучать крупные комплексы и мембранные белки в нативной среде без необходимости кристаллизации.
Молекулярное моделирование и докинг — компьютерные методы прогнозирования структуры и взаимодействий биомолекул на основе известных данных и физико-химических принципов.
Для комплексного анализа биомолекул применяются методы, оценивающие их физические свойства:
Ультрацентрифугирование — определяет молекулярную массу, форму и агрегатное состояние белков и нуклеиновых кислот.
Динамическое светорассеяние (DLS) — позволяет оценивать размер и полидисперсность частиц в растворе.
Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) — изучает диффузионные свойства и взаимодействия молекул в малых объёмах.
Методы биохимических исследований представляют собой комплекс инструментов, интегрирующих физику, химию и молекулярную биологию. Их сочетание позволяет выявлять структуру, функции и взаимодействия биомолекул с высокой точностью, обеспечивая фундамент для развития биохимии как науки и её практического применения в медицине, фармакологии и биотехнологии.