Иммунохимические методы представляют собой комплекс аналитических подходов, основанных на специфическом взаимодействии антигена и антитела. Высокая избирательность этих реакций делает их незаменимыми для количественного и качественного анализа белков, гормонов, ферментов, токсинов, вирусов и других биомолекул. Сущность методов заключается в образовании иммунных комплексов, которые могут быть выявлены различными физико-химическими способами, что позволяет судить о концентрации исследуемого вещества.
Антиген представляет собой молекулу, способную вызывать иммунный ответ и связываться со специфическими антителами. Антитела, или иммуноглобулины, — это белки плазмы крови, обладающие участками, комплементарными структуре антигена. Связывание происходит по принципу «ключ–замок» и характеризуется высокой специфичностью и прочностью взаимодействия, определяемой нековалентными силами — водородными связями, гидрофобными взаимодействиями, ван-дер-ваальсовыми силами и электростатическим притяжением.
Реакция антиген–антитело может происходить в растворе или на твердой фазе. Результатом взаимодействия является образование иммунных комплексов различной степени растворимости. В зависимости от используемого физико-химического принципа фиксации и измерения этих комплексов различают несколько классов иммунохимических методов.
Иммунохимические методы подразделяются на две основные группы: гетерогенные и гомогенные.
По способу регистрации сигнала выделяют радиометрические, ферментные, флуоресцентные, хемилюминесцентные и турбидиметрические методы.
Радиоиммунный анализ является одним из первых количественных иммунохимических методов. Он основан на конкуренции между меченым радиоизотопом и немеченым антигеном за связывание с антителами. По распределению радиоактивной метки между связанными и свободными фракциями определяют концентрацию исследуемого вещества.
Для мечения используют изотопы ^125I, ^3H или ^14C. Метод отличается высокой чувствительностью (до 10⁻¹² моль/л), но требует строгих мер радиационной безопасности и специального оборудования.
Ферментный иммуносорбентный анализ является наиболее распространённым методом в биохимии и клинической диагностике. Принцип ELISA основан на использовании фермента как метки вместо радиоактивного изотопа. При взаимодействии антигена и антитела, один из компонентов которых фиксирован на твердой фазе, образуется комплекс. Затем в реакцию вводится субстрат, который под действием фермента (пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.) превращается в окрашенное или флуоресцентное соединение.
Существует несколько вариантов ELISA:
Метод отличается высокой чувствительностью, стабильностью реагентов и безопасностью.
Иммунофлуоресцентный анализ использует флуоресцентные метки, такие как флуоресцеин, родамин или фитоэритрин. После взаимодействия антигена с антителом сигнал регистрируется при облучении ультрафиолетом. Иммунофлуоресценция применяется для визуализации антигенов в тканях и клетках, а также в количественных анализах.
Хемилюминесцентные методы основаны на способности определённых реакций с ферментными метками (например, с пероксидазой) вызывать свечение. Интенсивность излучения пропорциональна количеству иммунного комплекса. Эти методы отличаются высокой чувствительностью и быстрым получением результата.
Иммунотурбидиметрические и нефелометрические методы базируются на измерении оптической плотности или рассеяния света, возникающих при образовании нерастворимых иммунных комплексов. Они применяются для определения белков плазмы, иммуноглобулинов, С-реактивного белка и других макромолекул.
При турбидиметрии измеряется уменьшение интенсивности проходящего света, а при нефелометрии — интенсивность света, рассеянного под определённым углом. Методы просты, автоматизируемы и пригодны для массового клинического применения.
Иммунопреципитация используется для выделения антигенов из раствора с помощью антител, связанных с твердой фазой. После центрифугирования или осаждения комплекс извлекается и анализируется.
Иммуноблоттинг (Western blot) сочетает электрофорез белков с последующей их идентификацией с использованием специфических антител. После переноса белков на мембрану (обычно нитроцеллюлозную) и обработки антителами сигнал выявляется ферментным или флуоресцентным способом. Метод обеспечивает высокую специфичность и применяется для подтверждения результатов ELISA, анализа белковой экспрессии и выявления вирусных антигенов.
Современные тенденции развития иммунохимических методов связаны с миниатюризацией и автоматизацией анализов. Использование микропланшетов, магнитных частиц, микрочипов и наночастиц позволяет проводить многопараметрические исследования с минимальными объемами реагентов.
Разработаны иммунохимические биосенсоры, основанные на связывании антигенов с антителами на поверхности сенсора с последующей регистрацией изменений потенциала, проводимости или оптических свойств. Такие устройства применяются для экспресс-диагностики, экологического мониторинга и фармацевтических исследований.
Иммунохимические методы занимают ключевое место в современной аналитической биохимии. Они позволяют выявлять и количественно определять вещества в сложных биологических средах с высочайшей чувствительностью и специфичностью. Эти методы лежат в основе серологических тестов, диагностических наборов, определения гормональных уровней, маркеров опухолей, вирусных инфекций и аутоиммунных заболеваний.
Применение иммунохимии расширяется благодаря развитию нанотехнологий, оптических сенсоров и автоматических систем, обеспечивая переход от классических лабораторных анализов к интегрированным биохимическим платформам нового поколения.