Электрофоретические методы
Электрофоретические методы основаны на различиях в подвижности заряженных молекул под действием электрического поля. Движение частиц в электрическом поле определяется их зарядом, массой, формой и взаимодействием со средой, в которой происходит электрофорез. Эти методы занимают центральное место в биохимических исследованиях, обеспечивая разделение, идентификацию и количественный анализ белков, нуклеиновых кислот и других биомолекул.
При помещении смеси биомолекул в электрическое поле каждая частица движется к электроду, противоположно заряду её ионов: катионы — к катоду, анионы — к аноду. Скорость перемещения определяется электрофоретической подвижностью (μ), выражающейся соотношением:
[ μ = ]
где v — скорость миграции, E — напряжённость электрического поля. Электрофоретическая подвижность зависит от заряда молекулы (q), её радиуса (r) и вязкости среды (η).
Один из первых и наиболее простых методов, основанный на использовании фильтровальной бумаги, пропитанной буферным раствором. После нанесения образца и включения электрического поля ионы мигрируют по бумаге, образуя разделённые зоны. Бумажный электрофорез применялся преимущественно для разделения аминокислот, пептидов и небольших белков. Однако разрешающая способность метода ограничена из-за капиллярных эффектов и адсорбции веществ на целлюлозу.
Метод обеспечил значительное улучшение разрешающей способности за счёт введения гелевой матрицы, создающей пористую структуру, через которую молекулы проходят в зависимости от их размера. Используется для белков и ферментов, особенно при исследовании изоферментов и полиморфизма белков.
Наиболее распространённый метод лабораторного анализа белков и нуклеиновых кислот. Полиакриламидный гель представляет собой трёхмерную сетку с регулируемым размером пор, зависящим от концентрации акриламида и бис-акриламида.
Натрий-додецилсульфатный электрофорез (SDS-PAGE) применяется для денатурированных белков, лишённых вторичной и третичной структуры. Молекулы белков связываются с SDS, приобретая отрицательный заряд пропорционально длине полипептидной цепи. В результате разделение происходит по молекулярной массе, что делает метод стандартом для анализа белковых смесей.
Метод основан на разделении белков по их изоэлектрическим точкам (pI) — значениям pH, при которых суммарный заряд молекулы равен нулю. Для этого используют градиент pH, создаваемый с помощью амфолитов в геле. Белки мигрируют до тех пор, пока не достигнут области, где их заряд обнуляется, и концентрируются в виде узких полос. Изоэлектрическое фокусирование обладает исключительной точностью и широко применяется для изучения микровариантов белков и посттрансляционных модификаций.
Современный высокоэффективный метод, использующий узкие кварцевые капилляры, через которые проходит электролитный раствор. Благодаря малому диаметру капилляра достигается эффективное рассеяние тепла и высокая скорость разделения. Детекция продуктов осуществляется с помощью УФ-, флуоресцентных или масс-спектрометрических детекторов. Капиллярный электрофорез отличается точностью, воспроизводимостью и минимальным потреблением образца.
После завершения электрофореза зоны разделённых веществ фиксируются и окрашиваются. Для белков применяются кумассиевая синь, серебряное окрашивание, амид чёрный, для нуклеиновых кислот — бромид этидия или SYBR Green при флуоресцентной детекции. Современные цифровые системы обеспечивают количественный анализ интенсивности полос, что позволяет оценить концентрацию и степень чистоты образцов.
Двумерный электрофорез сочетает изоэлектрическое фокусирование и SDS-PAGE. На первом этапе белки разделяются по pI, а на втором — по молекулярной массе. Получается карта белков, где каждая точка соответствует отдельному белковому виду. Этот метод имеет ключевое значение в протеомике, позволяя анализировать тысячи белков одновременно.
Иммуноэлектрофорез объединяет электрофоретическое разделение и иммунологическое взаимодействие антиген–антитело. Используется для идентификации белков и диагностики патологических состояний.
Пульсирующее поле (PFGE) применяется для разделения крупных молекул ДНК (до миллионов пар оснований). Направление электрического поля периодически изменяется, что позволяет макромолекулам ориентироваться и проходить через гель с разной скоростью.
Электрофоретические методы являются основой аналитической биохимии. Они используются для:
Электрофорез занимает ключевое место среди инструментальных методов биохимии благодаря высокой разрешающей способности, универсальности и возможности сочетания с другими аналитическими техниками — масс-спектрометрией, иммуноанализом и спектроскопией.